PBMC相关图

爱白衣杀手

分离人外周血PBMC,全血用PBS稀释一倍后加到3ml70%percoll上方，1000g,20min离心，吸取血浆与percoll间约2ml液体，5倍以上PBS洗后细胞做流式（经过固定破膜步骤）得到此图(第一张)。这正常吗？经由CD3（FITC）判断（第二张）中间小部分是淋巴细胞，那右上角一大片是什么细胞？为什么会出现这种结果？第三张人肠道组织消化所得细胞取40%，70%之间取2ml细胞同样方案做流式，感觉淋巴细胞还是很少，图三是我自己画的门不知道对不对，请高手指点。         

PBMC图

niwanmao

爱白衣杀手 发表于 2015-3-17 14:36
图1是结肠消化下来的所有细胞，图2用ebioscience的活细胞试剂标记，图3是活细胞门内CD45标记，图4是图3门 ...

首先要说一下，这个CD45的电压太低了，阳性阴性没拉开。

1、图3的门内大部分都是淋巴细胞，或许混有一些巨噬细胞，如果需要证明是否全是淋巴细胞，需要用CD3、CD56、CD19三标确定。
2、圈淋巴细胞就跟科研一样，看你的目的而圈，所以不是存在公认的方法，但是对于在FSC/SSC散点图以及CD45/SSC的散点图上，淋巴细胞的圈门是有固定位置的，你圈的没有错，可以在第3个图后面再加一个FSC/SSC。
3、加CD14可以排除单核干扰，但是有了CD45，如果用SSC(log)的话，已经能够近乎完美排除单核细胞了，所以不是很有必要。

niwanmao

应该是你的PBMC提取有问题，建议参考这个PBMC提取的经典帖：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-827-1-1.html

爱白衣杀手

niwanmao 发表于 2015-3-16 21:12
应该是你的PBMC提取有问题，建议参考这个PBMC提取的经典帖：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-827-1-1.ht ...

谢谢倪老师，长知识了。但是我还想知道，第三第四幅图肠道林巴细胞怎么会是这种图？肠组织血细胞很少，也不存在帖子里的严格抗凝问题。另外percoll离心后吸取多少液体合适？或者说不能大于多少体积？

niwanmao

爱白衣杀手 发表于 2015-3-16 21:40
谢谢倪老师，长知识了。但是我还想知道，第三第四幅图肠道林巴细胞怎么会是这种图？肠组织血细胞很少，也 ...

这就体现出细胞死活鉴别染料的重要性。组织消化后，很容易出现细胞死亡或活力欠佳的情况，此时，加一个细胞死活鉴别染料，可以排除掉大部分的非特异性染色。

对于你的实验，加个细胞死活鉴别染料和CD45，你图中的细胞分群就会很清楚了。现在因为被大量的死细胞或活力差的细胞干扰，再加上很多实体组织细胞，造成分群乱糟糟。

爱白衣杀手

niwanmao 发表于 2015-3-17 08:31
这就体现出细胞死活鉴别染料的重要性。组织消化后，很容易出现细胞死亡或活力欠佳的情况，此时，加一个细 ...

倪老师，您说的我都做了的。想上图回复您上不了啊。高级模式编辑不了啊，怎么办？

niwanmao

爱白衣杀手 发表于 2015-3-17 10:58
倪老师，您说的我都做了的。想上图回复您上不了啊。高级模式编辑不了啊，怎么办？ ...

点击回复，在弹出的回复框点击“高级模式”，就可以上传附件或图片了。如果点击没有反应，可能是浏览器的问题。

爱白衣杀手

niwanmao 发表于 2015-3-17 13:28
点击回复，在弹出的回复框点击“高级模式”，就可以上传附件或图片了。如果点击没有反应，可能是浏览器的 ...

所有肠道消化细胞

进行活细胞分析

CD45标记

CD3，ROR标记

图1是结肠消化下来的所有细胞，图2用ebioscience的活细胞试剂标记，图3是活细胞门内CD45标记，图4是图3门内CD3标记。有几个问题：1.图3门内细胞全是淋巴细胞吗？如果是的话这种圈淋巴细胞的方法公认吗？2.如何从肠道消化的细胞中准确圈出淋巴细胞？有什么公认的，稳定的方法？3.用CD45+CD14-从所有细胞中圈淋巴细胞可以吗？求解答。

爱白衣杀手

niwanmao 发表于 2015-3-17 15:00
首先要说一下，这个CD45的电压太低了，阳性阴性没拉开。

1、图3的门内大部分都是淋巴细胞，或许混有一些 ...

非常感谢倪老师的耐心解答，今天才知道CD45/SSC可以这么漂亮的圈出淋巴细胞。我的问题也解决了，再次感谢倪老师！