请问如何看小鼠PBMC的分群？

cllo33

各位老师好~
我最近在做一个淋巴和单核细胞焦亡检测的实验，因此用Ficoll提出了PBMC，然后想用APC-CD3和PE-CD14区分淋巴和单核细胞后再看各自的焦亡；现在的问题单染CD14重复了好多次都染不出来，CD3一直都很稳定，每次CD3和CD14都是同时同条件做的。
为验证抗体是否好用，分别做了全血破红、脾细胞和PBMC提取后染CD3和CD14，都没有做出来。这是这几次做的结果。

全血破红：

全血破红后 空白

全血破红后 APC-CD3

全血破红后 PE-CD14

脾细胞：

splenocyte

splenocyte APC-CD3

splenocyte PE-CD14

PBMC：

PBMC

想请问各位老师：
1. 从全血里面提取PBMC，用CD3、CD14标记淋巴、单核细胞再看焦亡，这样可行吗？
2. 从PBMC的FSC-SSC散点图上能否圈出单核细？
3. 为什么CD14染不出来？

谢谢各位老师，刚开始接触流式就碰到这个问题，困扰了很久了，中间换过一次抗体也不行

niwanmao

1、提取可行，但对操作要求比较高，有可能，可直接标记，然后裂红会比较好。方便、快捷。
2、从上面的FSC和SSC图看，脾脏还可以，但第一个FSC/SSC看着明显像是碎片或死细胞。
3、我的建议首先用正常人的外周血标记一下，测试一下CD14抗体的问题，如果CD14抗体能够排除掉，那么就是细胞提取上的问题，可能提取时细胞提死了。

cllo33

niwanmao 发表于 2017-12-21 17:42
1、提取可行，但对操作要求比较高，有可能，可直接标记，然后裂红会比较好。方便、快捷。
2、从上面的FSC和 ...

非常感谢倪老师
人血只做过PBMC，CD14也是染不出；

人PBMC

小鼠的脾细胞做过加染SYTOX-blue区分死细胞，细胞死亡的不多。

otoizz

单核细胞比较大一些，FSCSSC圈门和T细胞不在一起，一般偏右上角，设置这两个参数电压的时候要兼顾一下。小鼠染单核巨噬细胞一般不用CD14，但小鼠巨噬细胞应该也表达CD14.现有的数据你可以圈右上角压线的细胞分析一下。

niwanmao

cllo33 发表于 2017-12-22 10:02
非常感谢倪老师
人血只做过PBMC，CD14也是染不出；

可以跟代理商反馈一下。

chevalierx

对于mouse的circulating monocyte，不常用CD14标记，在非活化的patrolling monocyte上，综述标记是Ly-6CloCX3CR1hiCCR2lo，而活化的inflamed monocyte，综述标记是Ly-6ChiCX3CR1loCCR2hi，我自己实验用的标记是Ly-6ChiF4/80hiCD11c-CD11b+，和human不同，非活化的mouse monocyte可能CD14表达不高（但我没有验证过），类似于部分tissue-resident macrophage。关于大小，从FSC的角度可能和activated neutrophil差不多，但是明显小于activated macrophage，双Lin可以看到明显分群。

niwanmao

chevalierx 发表于 2017-12-24 23:13
对于mouse的circulating monocyte，不常用CD14标记，在非活化的patrolling monocyte上，综述标记是Ly-6CloC ...

@cllo33 应该染的是脾巨噬细胞吧。

chevalierx

niwanmao 发表于 2017-12-25 14:24
@cllo33 应该染的是脾巨噬细胞吧。

他不是分别做了全血，脾细胞和PBMC么。。。一般小鼠的巨噬细胞通用标记用F4/80比较多，BD的CD marker handbook里面，人macrophage/monocyte的标记是CD14，鼠是F4/80。。。如果是脾巨噬细胞，CD14表达量低是有可能的，因为属于tissue-resident macrophage，origin不是bone marrow-derived，在steady state下不一定高表达CD14，建议LZ查下相关文献。。。另外建议楼主检测下自发荧光，例如同属于tissue-resident macrophage的AM的自发荧光就在500-650之间。。。