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流式检测,细胞死活还是要先分清的

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发表于 2018-6-28 17:58:15 | 显示全部楼层 |阅读模式

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有没有注意到,我们之前发布的OMIP系列文献(http://www.flowcyto.cn/bbs/forum ... ion=view&ctid=6)中,头几个图大多是排除粘连体和排除死细胞。对于样本不够新鲜或者无法保证样本质量的情况下,为什么区分细胞死活这么重要?

看一下下面这个典型的图,死细胞的分布会对抗原表达产生极大干扰,从而会对结果产生极大的偏倚:
Dead.jpg


那么死活细胞染料究竟有哪些呢?

商品化死活鉴别染料
目前市场上比较常见的商品化死活鉴别染料见下表,表中列出了激发光和发射光波长,以及适用的激光器。主要由Thermo Fisher、Biolegend、BD、eBioscience等公司提供,染料性质均为共价分子染料,原理基本上都是结合细胞表面和内部的胺分子,因此固定对此类染料影响不太大:
屏幕快照 2018-06-28 下午2.29.25.png


自配染料
商品化染料比较略贵,由于有些朋友经费有限,或者舍不得购买商品化染料,或者对荧光通道要求不高,并且染色步骤不涉及到固定破膜的,可考虑自配。
自配的话,染料就没这么高档,大多是利用DNA结合的核酸染料,利用死细胞膜通透性增高的原理。

PI(碘化丙啶)
常用浓度为2ug/ml。
这种DNA结合染料即使在低浓度下也非常明亮,并且具有广泛的发射范围,可以在PE(575/26 nm滤光片)或远红光检测通道(通常是红色的660-690 nm BP或LP滤光片)中检测到,可以使用传统的PE检测器(“FL2”检测器,575/26纳米),也可以使用PE-Cy5检测器(“FL3”检测器,675/20纳米 BP或650nm LP滤波器)检测。因此,在荧光素搭配上,要避免这两个通道的荧光素共用。
PI电荷很高,会污染仪器管道, PI使用后,应使用10%漂白剂或其他去污剂彻底清洁仪器以去除染料。

7-AAD
常用浓度为5ug/ml
这种DNA结合染料不像PI那么亮,并且发射远红光,使得它可以在大多数单激光流式细胞仪(PE-Cy5或“FL3”检测器,675 / 20nm BP或650 nm LP滤波器)。 SYTOX AADvanced是一种7-AAD变体,可替代7-AAD。

Hoechst 33258、DAPI、SYTOX
Hoechst 33258非常明亮,可以使用紫外或紫外激光源激发。 通过450/50 nm或类似的滤波器进行检测。不要将Hoechst 33258和33342混淆起来,Hoechst 33342具有更高的细胞渗透性,不适合作为死活细胞鉴别。 DAPI也可用作渗透性染料,并具有类似于Hoechst 33258的光谱性质。SYTOX Blue也是紫激发的并且发射蓝光。像PI一样,这三类染料均带有很高的电荷,并且会紧紧地固定在仪器管路上,仪器使用后应使用10%漂白剂或其他清洁剂彻底清洁。
Hoechst 33258常用浓度为2ug/ml,DAPI常用浓度为2ug/ml,SYTOX Red、SYTOX Blue的储存液浓度5mM,使用时按照1:1000加入。

以上染料用量大多为500ul。


参考文献:
Flow Cytometry Protocols-Humana Press (2018)

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发表于 2021-12-5 19:58:32 | 显示全部楼层
请教一下,死活染料和其他抗体需不需要做单染补偿?如果需要的话,空白对照、其他抗体的单染补偿以及FMO里面要不要加死活染料?
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发表于 2022-8-8 15:42:44 | 显示全部楼层
这个经典的流式图是在哪个文献上的呀
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发表于 2023-7-1 01:38:28 | 显示全部楼层
各位大佬,新手想问一下细胞经固定之后不是死了吗,那染死活染料还有什么用呢
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 楼主| 发表于 2023-7-1 07:40:32 来自手机 | 显示全部楼层
lukequ 发表于 2023-7-1 01:38
各位大佬,新手想问一下细胞经固定之后不是死了吗,那染死活染料还有什么用呢 ...

包含固定和破膜步骤的时候,不能用核酸类死活染料,但是可以用商品化适用于固定破膜的死活染料
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