流式检测，细胞死活还是要先分清的

niwanmao

有没有注意到，我们之前发布的OMIP系列文献（http://www.flowcyto.cn/bbs/forum ... ion=view&ctid=6）中，头几个图大多是排除粘连体和排除死细胞。对于样本不够新鲜或者无法保证样本质量的情况下，为什么区分细胞死活这么重要？

看一下下面这个典型的图，死细胞的分布会对抗原表达产生极大干扰，从而会对结果产生极大的偏倚：



那么死活细胞染料究竟有哪些呢？

商品化死活鉴别染料
目前市场上比较常见的商品化死活鉴别染料见下表，表中列出了激发光和发射光波长，以及适用的激光器。主要由Thermo Fisher、Biolegend、BD、eBioscience等公司提供，染料性质均为共价分子染料，原理基本上都是结合细胞表面和内部的胺分子，因此固定对此类染料影响不太大：



自配染料
商品化染料比较略贵，由于有些朋友经费有限，或者舍不得购买商品化染料，或者对荧光通道要求不高，并且染色步骤不涉及到固定破膜的，可考虑自配。
自配的话，染料就没这么高档，大多是利用DNA结合的核酸染料，利用死细胞膜通透性增高的原理。

PI（碘化丙啶）
常用浓度为2ug/ml。
这种DNA结合染料即使在低浓度下也非常明亮，并且具有广泛的发射范围，可以在PE（575/26 nm滤光片）或远红光检测通道（通常是红色的660-690 nm BP或LP滤光片）中检测到，可以使用传统的PE检测器（“FL2”检测器，575/26纳米），也可以使用PE-Cy5检测器（“FL3”检测器，675/20纳米 BP或650nm LP滤波器）检测。因此，在荧光素搭配上，要避免这两个通道的荧光素共用。
PI电荷很高，会污染仪器管道， PI使用后，应使用10％漂白剂或其他去污剂彻底清洁仪器以去除染料。

7-AAD
常用浓度为5ug/ml
这种DNA结合染料不像PI那么亮，并且发射远红光，使得它可以在大多数单激光流式细胞仪（PE-Cy5或“FL3”检测器，675 / 20nm BP或650 nm LP滤波器）。 SYTOX AADvanced是一种7-AAD变体，可替代7-AAD。

Hoechst 33258、DAPI、SYTOX
Hoechst 33258非常明亮，可以使用紫外或紫外激光源激发。 通过450/50 nm或类似的滤波器进行检测。不要将Hoechst 33258和33342混淆起来，Hoechst 33342具有更高的细胞渗透性，不适合作为死活细胞鉴别。 DAPI也可用作渗透性染料，并具有类似于Hoechst 33258的光谱性质。SYTOX Blue也是紫激发的并且发射蓝光。像PI一样，这三类染料均带有很高的电荷，并且会紧紧地固定在仪器管路上，仪器使用后应使用10％漂白剂或其他清洁剂彻底清洁。
Hoechst 33258常用浓度为2ug/ml，DAPI常用浓度为2ug/ml，SYTOX Red、SYTOX Blue的储存液浓度5mM，使用时按照1:1000加入。

以上染料用量大多为500ul。


参考文献：
Flow Cytometry Protocols-Humana Press (2018)

szmraymond

请教一下，死活染料和其他抗体需不需要做单染补偿？如果需要的话，空白对照、其他抗体的单染补偿以及FMO里面要不要加死活染料？

飞翔

这个经典的流式图是在哪个文献上的呀

lukequ

各位大佬，新手想问一下细胞经固定之后不是死了吗，那染死活染料还有什么用呢

niwanmao

lukequ 发表于 2023-7-1 01:38
各位大佬，新手想问一下细胞经固定之后不是死了吗，那染死活染料还有什么用呢 ...

包含固定和破膜步骤的时候，不能用核酸类死活染料，但是可以用商品化适用于固定破膜的死活染料