小鼠脾脏Treg检测之固定破膜

dsq2018

最近一直在做小鼠脾脏淋巴细胞分离实验，需要检测Treg比例变化，但发现进行核内染色后脾脏淋巴细胞群大量丢失，不知道是什么原因。下图阴性管可见明显的淋巴细胞分群（细胞分出来后未做任何处理），CD4单阳管也可见明显的淋巴细胞群（仅进行膜染色），单Foxp3单阳管细胞群与前面明显不同，不知道原因是什么？使用的是BD公司的Fix/Perm试剂进行固定和破膜的，离心600g 5min

ghqiu09

细胞都破了或者都死了，操作的过程还是需要注意一下，然后细胞可以稍微多加一些，破核膜的是比较讨厌

dsq2018

ghqiu09 发表于 2018-10-12 19:53
细胞都破了或者都死了，操作的过程还是需要注意一下，然后细胞可以稍微多加一些，破核膜的是比较讨厌 ...

谢谢，我也觉得是细胞都破了，操作已经很小心了，我在考虑是不是要缩短Fix/Per的量和作用时间，按照说明是1ml 4度40分钟，今天上午已经试了500ul 30分钟，但还是都破了，不知道是不是离心速度过大（已由600g降至400g 5min，说明书推荐350g 6min），还是进行了漩涡震荡，还是固定破膜之后没有用公司提供的洗涤液（容易产生泡沫）进行洗涤，还是因为染色完成后放置了约2小时才上机检测？谢谢老师指导

mybiosciences

很明显细胞都成碎片了
严格按照说明书操作应该不会有问题
染色之前要做细胞计数

niwanmao

dsq2018 发表于 2018-10-12 21:40
谢谢，我也觉得是细胞都破了，操作已经很小心了，我在考虑是不是要缩短Fix/Per的量和作用时间，按照说明是 ...

用量不要随意更改，中间的Washing Buffer也尽量用试剂盒内的。
如果担心操作的问题，可以用其它比较常见的样本，不染色练练手看。