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[细胞增殖] 请大家帮忙分析一下我做的CFSE细胞增殖数据

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发表于 2019-8-7 20:36:10 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
各位老师:
       我前几天第一次做了CFSE细胞增殖实验,其大概是:分离鸡脾脏淋巴细胞,然后取2×107细胞重悬在0.5ml PBS中(置于15ml离心管,包裹锡箔纸)。在另一15ml离心管中加入5ml PBS,马上加入2ul CFSE储存液(5mM),上下颠倒几下后,取0.5ml 稀释的CFSE溶液到0.5ml 细胞中(此时CFSE终浓度为1uM),吹打几下后置于37度水浴10min,每隔2min晃动一次细胞。染色结束后加入5倍体积预冷的RPMI1640+10%FBS,置于冰上5min,300g离心6min,然后再用RPMI1640+10%FBS洗涤两次。最后计数细胞。24孔板每孔加一百万细胞阳性对照孔加入终浓度为5ug/ml的ConA,其他孔加入终浓度为15ug/ml的肽溶液。24孔板包裹锡箔纸后置于细胞培养箱中孵育4天。孵育结束后每孔加入终浓度为2mM的EDTA,室温作用10min,收集细胞进行CD4和CD8的表面染色,最后重悬在1%多聚甲醛中进行流式分析。结果如下图所示,不管是阳性对照还是样品孔均没有出现细胞增殖现象,都是单峰。请老师们帮忙分析一下是什么原因造成的,我可以从哪些方面进行优化?谢谢大家。
在此顺便请教大家几个问题:1、稀释CFSE的时候需要完全避光吗?关灯之后看得不是很清楚。
                                          2、细胞铺板结束后可以在显微镜下看一下细胞密度吗?


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CD8

CD8

CD4

CD4
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发表于 2019-8-8 22:45:24 | 显示全部楼层
父代的没做?

从图上看,应该有子代峰,但需要通过父代峰位置来确定一下。
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发表于 2019-8-9 09:12:58 | 显示全部楼层
从FSC vs SSC点图看,细胞确实没有明显增殖,你应该从培养体系上找原因。
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 楼主| 发表于 2019-8-9 09:59:31 | 显示全部楼层
tiger 发表于 2019-8-9 09:12
从FSC vs SSC点图看,细胞确实没有明显增殖,你应该从培养体系上找原因。

谢谢老师您的指点,我想问下培养体系应该怎么调整呢。
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 楼主| 发表于 2019-8-9 10:01:36 | 显示全部楼层
tiger 发表于 2019-8-9 09:12
从FSC vs SSC点图看,细胞确实没有明显增殖,你应该从培养体系上找原因。

老师您帮忙看下这个图,是否发生了增殖?谢谢
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发表于 2019-8-9 15:27:50 | 显示全部楼层
行棋无悔 发表于 2019-8-9 10:01
老师您帮忙看下这个图,是否发生了增殖?谢谢

这个样品有少部分细胞增殖,大部分细胞坏死,你用死活染料验证一下。再有圈定淋巴细胞,移动此门看增殖峰有无变化。如果是死亡细胞太多,可下调一下初始细胞浓度,可能细胞浓度太密导致。
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