人PBMC体外培养20H，单核细胞亚群比例异常

sky_loney

各位老师，我在做单核细胞吞噬实验，异物溶解与DMSO，最终控制异物在培养基中的浓度为2ug/ml，但在共同培养20h后，单核细胞亚群从正常分群转变为中间型为主，但却找不到原因，各位老师有遇到这种情况吗

niwanmao

不知道你这里上级门是否设置正确，细胞活力如何？

sky_loney

niwanmao 发表于 2021-8-30 09:11
不知道你这里上级门是否设置正确，细胞活力如何？

倪老师，这是我的上级图，单核细胞分群应该没划错，但未做活力检测，若单核细胞死亡，CD16表达会明显增高吗？还望解答，感谢！

niwanmao

sky_loney 发表于 2021-8-30 09:40
倪老师，这是我的上级图，单核细胞分群应该没划错，但未做活力检测，若单核细胞死亡，CD16表达会明显增高 ...

从FSC和SSC的图上看，感觉单核细胞状态应该还可以，如果状态不佳，是可能导致一些非特异性染色。

那么我建议这样，你是否染一管Fc阻断+CD14 APC染色的，用于设置CD16的位置。

sky_loney

niwanmao 发表于 2021-8-30 11:12
从FSC和SSC的图上看，感觉单核细胞状态应该还可以，如果状态不佳，是可能导致一些非特异性染色。

那么我 ...

我的实验确实没做Fc受体阻断。不过我没理解您的意思。据我理解，做Fc受体阻断+CD14的单染阳性对照管，只能排除CD14-APC的非特异染色。您是建议我做Fc受体阻断+CD16的单染阳性对照管吧？

sky_loney

niwanmao 发表于 2021-8-30 11:12
从FSC和SSC的图上看，感觉单核细胞状态应该还可以，如果状态不佳，是可能导致一些非特异性染色。

那么我 ...

倪老师，今日做了一批样本均用Fc受体阻断，但分群仍以中间型为主。我的步骤是提取PBMC的后，PBS洗涤两次后，我用RPMI+10%FBS培养基稀释成2E+6/ml，置于24孔板，每孔2ml，20h后弃上清，PBS润洗后，用0.25%胰酶消化5min，吹打孔板得细胞后进行染色，最后用4%PFA重悬。不知哪里出现问题？还请倪老师指教。