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[标本处理] 小白报道,人外周血裂解后,图里左下一大团是红细胞碎...

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发表于 2021-11-15 17:21:16 | 显示全部楼层 |阅读模式

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小白一枚,想做单核细胞亚群分析,用自配的裂红液,为什么看到的细胞群和书上常看到的那种散点图分布不一样呢,左下那一大群细胞是红细胞碎片吗,还是淋巴细胞啊......

未加抗体

未加抗体

加入了CD16的APC偶联抗体

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散点图.PNG
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
发表于 2021-11-18 20:01:42 | 显示全部楼层
huming 发表于 2021-11-18 07:41
老师,我还想请教,裂红的环境条件有什么要求吗,温度、是否避光、离心的转数或时间,裂红时室温避光10min ...

裂解红细胞的温度是室温,如果有抗体孵育过,需避光;离心一般500g,5分钟。
如果你用2ml裂解不干净,通常说明你的配制上或原材料上有问题。
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2021-11-15 21:49:22 | 显示全部楼层
1、红细胞裂解后,离心之后是否有红色沉淀?
2、FSC和SSC为何用LOG?

PS:发帖求助,请发在提问版块,不要发在分享版块,此次先帮你转移过去,下不为例,谢谢配合。
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 楼主| 发表于 2021-11-16 00:19:21 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-11-15 21:49
1、红细胞裂解后,离心之后是否有红色沉淀?
2、FSC和SSC为何用LOG?

1、离心之后有红色沉淀,后来用pbs又洗了两次,上样的时候没有了。
2、非正版商用软件,参数轴里没有单独的FSC或SSC选项,但是点轴旁边的T,可以选择为线性轴或数坐标,不知道您是不是说这个

谢谢倪老师!
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发表于 2021-11-16 07:29:55 | 显示全部楼层
huming 发表于 2021-11-16 00:19
1、离心之后有红色沉淀,后来用pbs又洗了两次,上样的时候没有了。
2、非正版商用软件,参数轴里没有单独 ...

1、离心后有红色沉淀,说明未裂解完全,如确定裂解液配制无问题,应该是裂解液加的太少。我们一般是50ul样本+2~3ml裂解液,室温10分钟。如果担心裂解不干净,可加到5ml。
2、FSC和SSC建议用线性显示,才能看到经典图形。
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 楼主| 发表于 2021-11-17 22:57:58 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-11-16 07:29
1、离心后有红色沉淀,说明未裂解完全,如确定裂解液配制无问题,应该是裂解液加的太少。我们一般是50ul ...

裂解液是按照咱们论坛您推荐的那个经典配方配的, pH值在7.2左右,我是100μL的人外周血先加了荧光抗体孵育,然后加2mL的裂解液,这么看应该是裂解液加的少。二次裂红和首次多加裂解液有什么区别吗,二次裂红是用PBS洗了一次之后,向细胞沉淀加了2mL的裂红液,感觉大多数管还是会有红色沉淀,少数管看不到红色沉淀了
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 楼主| 发表于 2021-11-18 07:41:04 | 显示全部楼层
老师,我还想请教,裂红的环境条件有什么要求吗,温度、是否避光、离心的转数或时间,裂红时室温避光10min,然后350g离心5分钟,PBS洗涤,500g离心3分钟,这样的步骤和条件有什么问题吗
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 楼主| 发表于 2021-11-18 23:01:04 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-11-18 20:01
裂解红细胞的温度是室温,如果有抗体孵育过,需避光;离心一般500g,5分钟。
如果你用2ml裂解不干净,通 ...

今天加了4mL裂解液,感觉红色沉淀明显比之前少了,第一次裂红之后感觉倒上清液倒的不干净,有一些液体残留,这个您通常是怎么操作的呢,在吸水纸上倒扣可以吗,或者是甩一甩可以吗
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发表于 2021-11-19 08:10:06 | 显示全部楼层
huming 发表于 2021-11-18 23:01
今天加了4mL裂解液,感觉红色沉淀明显比之前少了,第一次裂红之后感觉倒上清液倒的不干净,有一些液体残 ...

倒完在吸水纸上碰一下,把管口吸干即可,少量残留液体是正常的。但是如果4ml仍有红色沉淀,说明你的原材料或配制肯定有问题。
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