流式检测细胞自噬？

niwanmao

标题：流式检测细胞自噬？
可否用流式检测药物作用后细胞自噬的情况？
比如用吖啶橙染色。。。
问题补充： 为什么需要破膜呢？
我们这教的是直接拿配好的吖啶橙染贴壁细胞，然后消化，用含10%FBS的PBS终止消化后直接上流式检查。。因为是单染，所以不是很清楚怎么区分阳性细胞群。
要是能有几张标准的流式图看看就好了、、、
谢谢高手了。。。


回答者：niwanmao
当然可以用吖啶橙来检测细胞中的酸性囊泡，来反应细胞自噬程度。
大概在2008年我帮别人测过，具体方法我当时从Current protocol in cytometry中翻译过，请参见如下：

材料：

• 细胞密度≤10⁶/ml，悬浮在包含10％血清的培养基中
• 吖啶橙染液，冰冷（详细配制见文末 。AO-DNA或AO-RNA的激发波长为488nm，发射波长分别为530±15nm[FL1]、640nm[FL3]）
• 细胞破膜剂，冰冷（详细配制见文末）
  

具体步骤：

• 转移0.2ml细胞悬液到流式管中，置于冰上。（0.2ml应该有≤2×10⁵的细胞，培养基中的10％血清或1％的BSA可以保护细胞以免被去污剂裂解）
• 轻轻加入0.4ml冰冷的细胞破膜剂，置于冰上等待15秒钟。
• 轻轻加入1.2ml冰冷的吖啶橙染液，置于冰上，避光。
• 在加入吖啶橙染液后的2～10分钟内检测和记录细胞的荧光。（注意：检测前和检测中标本都应该置于冰上。如果以涡旋振荡或注射方式把细胞加入破膜剂中，尤其是在没有血清或其它蛋白保护时，可能会导致胞膜破裂或胞核分离出来。）
  

需自配的部分试剂：

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2009年8月12日 0:54

小小研究生

小小研究生 发表于 2015-7-7 19:58
我这次用AO染色，荧光显微镜下成像。可以清楚的看到红色或黄色荧光没有使用破膜剂，浓度是自己摸索的，接下 ...

这是一篇关于AO染色，流式的文献
有一个小问题，流式图形看那一部分？是右上角的百分比，还是全部上面部分的百分比？

marshlin

Protective Effect of Autophagy in Laser-Induced Glioma Cell Death In Vitro 2010 这篇文献中并没提到用细胞破膜剂进行操作。
而且我们做过只用荧光显微镜拍照的AO自噬染色，是终浓度1μM，也不用破膜剂。
接着我们也准备用流式去做，做好后结果再跟大家讨论。

niwanmao

marshlin 发表于 2012-7-9 09:30

                               
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Protective Effect of Autophagy in Laser-Induced Glioma Cell Death In Vitro 2010 这篇文献中并没提到用 ...

吖啶橙本身就具备直接渗透，应该是可行的，但染色的强度就不清楚了。期待你的分享

simon911

学习下咯

小小研究生

我这次用AO染色，荧光显微镜下成像。可以清楚的看到红色或黄色荧光没有使用破膜剂，浓度是自己摸索的，接下来准备做流式了。有结果再分享。。。

小小研究生

老师，做流式AO检测自噬，我应该怎么样画门？使用FL3-FL1log 形式？请老师解答

niwanmao

小小研究生 发表于 2015-7-8 17:54
老师，做流式AO检测自噬，我应该怎么样画门？使用FL3-FL1log 形式？请老师解答 ...

是的。

风过即逝

老师，您好，我一直不太清楚AO染色是红色标出的到底是酸性囊泡还是RNA，两者相互矛盾吗，期待您的解答！

niwanmao

风过即逝 发表于 2018-1-2 21:37
老师，您好，我一直不太清楚AO染色是红色标出的到底是酸性囊泡还是RNA，两者相互矛盾吗，期待您的解答！ ...

这确实是个问题，RNA应该还是无法排除干扰的，我也找了好多测自噬的文章，似乎也都没有提及对RNA的处理。