调节补偿时单染管的阳性率在95%以上，阴性细胞群没有

chaoslure

在做干细胞的流式补偿时遇到这样一个问题，由于干细胞经分离培养细胞的纯度很高，在进行流式分析时，我们按照常规流式操作，第一管阴性对照，第二管FITC单标+PE-IG，第三管PE单标+FITC+IG，第四管PE+FITC双标。在第二管和第三管可以看到阳性率很高几乎看不到阴性细胞群。通常在调节补偿时需要一次上样既有阴性细胞群又有阳性细胞群，出现这种情况我们应该如何调节补偿？

我想到两个思路希望各位老师指点一下：
方法一：
在实验过程中，既然第二管和第三管没有阴性细胞群，那么我们可以制造阴性细胞群，比如在上样前将第一管的细胞取部分加入到第二管和第三管中。
方法二：
在分析过程中，在分析时第二管和第三管没有阴性细胞群，我们可以将第一管的图做为阴性对照，分别计算三管细胞的EP和FITC的MFI值，手动调整补偿矩阵让第一管的MFI-PE≈第二管的MFI-PE，第一管的MFI-FITC≈第三管的MFI-FITC。
不知哪种方法更好，或者有更好的调节补偿方法？请各位老师指点一下。

niwanmao

chaoslure 发表于 2020-2-16 10:00
倪老师，因为有些实验按照之前的方法已经做完了，无奈之下只能按照方法二分析数据，所以想跟您请教一下， ...

不混在一起，处理过程中的差异、上机时的差异，都会影响两者的相对位置，造成补偿不准。

niwanmao

用方法一

chaoslure

niwanmao 发表于 2020-2-14 11:00
用方法一

倪老师，因为有些实验按照之前的方法已经做完了，无奈之下只能按照方法二分析数据，所以想跟您请教一下，用方法二分析数据会出现那些不足的地方，分析得到的结果是否可信？

闷油瓶

niwanmao 发表于 2020-2-14 11:00
用方法一

用方法一的话，第一管的意义是啥？

niwanmao

闷油瓶 发表于 2021-4-14 13:14
用方法一的话，第一管的意义是啥？

第一管如果同型对照没有加，那么严格的叫法叫「空白对照」，仅用于调节电压；

如果加了同型对照，就叫「同型对照」，在isotype选择正确的情况下，可用于反映背景荧光和非特异性结合水平。

闷油瓶

niwanmao 发表于 2021-4-14 13:42
第一管如果同型对照没有加，那么严格的叫法叫「空白对照」，仅用于调节电压；

如果加了同型对照，就叫「 ...

是不是在方法一的情况下，第一管如果是同型对照管，就可以用来调节电压和补偿，把那群细胞非特异性荧光完全调到阴性位置，然后用第一管设置好的电压和补偿来跑第二管和第三管，分别调节第二管和第三管的补偿就可以了？我也是新手，希望老师不要嫌弃

niwanmao

闷油瓶 发表于 2021-4-14 16:59
是不是在方法一的情况下，第一管如果是同型对照管，就可以用来调节电压和补偿，把那群细胞非特异性荧光完 ...

第2、3管如果同时有阳性和阴性群，是可以。
但楼主说的是，2、3管没有阴性群，所以就不行。

闷油瓶

niwanmao 发表于 2021-4-14 19:44
第2、3管如果同时有阳性和阴性群，是可以。
但楼主说的是，2、3管没有阴性群，所以就不行。 ...

那我学习的时候可能理解错了，我理解的是用阴性细胞（第一管）确定阴性边界，然后用单染管确定每种荧光在其他通道的溢漏来调好补偿（不用阴性细胞，只要有阳性信号即可），然后用阳性管来正式测量

niwanmao

闷油瓶 发表于 2021-4-16 16:06
那我学习的时候可能理解错了，我理解的是用阴性细胞（第一管）确定阴性边界，然后用单染管确定每种荧光在 ...

阴性细胞确定界限没错，但此阴性非彼阴性。这里的所谓“阴性”是空白对照，真正的阴性应该是：
1、生物学阴性对照（即同一个样本或同一类样本，不表达该标记）。
2、FMO对照。