原代细胞流式分选后做RNA提取，样品制备过程应该注意哪...

gaocx

我近期需要将小鼠肺组织细胞提取后，用流式分选其中的部分细胞，进行后续的RNA-seq。

由于我还没做过分选，想请教一下大家：
1）是不是细胞提取、染色过程都应该去除RNase，我目前看了几篇文献，倒是都没有刻意指出要去除
2）细胞提取过程是不是越快越好呢？我的样品比较多，提取加染完一般都傍晚了，再过夜是不是不太好？
3）收集液用什么比较好?我看到有的文献直接用了trizol，但分选出来的细胞不是带有鞘液吗，会不会有影响？

niwanmao

首先说明一下，我没做过，纯粹从理论上进行讨论，如有不当之处，请有经验的FLOWER指出。

1、我觉得应该要加，至于文献未指出，是否与写文章的人有时候不一定是操作者，在某些细节上不一定描述到位？
2、提取过程肯定是越快越好，为了速度起见，是否有可能减少一次处理的样本数呢？
3、收集液，平时看到的资料一般是「含有RNase抑制剂的裂解液」，Trizol是可以的，主要是为了避免RNA降解，同时起到一定裂解作用，加速后续步骤，所以稀释是次要的。

以上意见，仅供参考。

gaocx

niwanmao 发表于 2021-1-6 16:26
首先说明一下，我没做过，纯粹从理论上进行讨论，如有不当之处，请有经验的FLOWER指出。

1、我觉得应该要 ...

收到，谢谢倪老师！

gaocx

niwanmao 发表于 2021-1-6 16:26
首先说明一下，我没做过，纯粹从理论上进行讨论，如有不当之处，请有经验的FLOWER指出。

1、我觉得应该要 ...

还想请教一下倪老师，我的细胞比例较低，是否需要预先用MACS纯化一下再进行分选？只是我们的MACS比较缓慢，是用柱子的那种。

所以我们是应该把分选的时间放在MACS上还是FACS上呢？

niwanmao

gaocx 发表于 2021-1-6 17:27
还想请教一下倪老师，我的细胞比例较低，是否需要预先用MACS纯化一下再进行分选？只是我们的MACS比较缓慢 ...

流式是能够直接进行稀有细胞的分选的，我个人觉得还是直接用流式分选比较好一点，否则先磁珠，再流式，这中间的过程更长了，反而影响细胞得率和活力。

TMU-1107

楼主，倪老师好，流式小白一个，目前也是想分选出某一细胞后做测序，请问用死活染料PI染细胞我看是不能洗，直接上机，但PI时间久了对细胞活力也有伤害，是先染完我的Marker之后再染PI上机分选？那分选过程中我的活性不好的细胞会不会持续增加，影响收集到的细胞数目。如果我不染这个死活染料，直接染Marker分选可行吗，会影响后续测序质检吗？谢谢。还有就是PI是不是和PE广泛交叠，我的Marker分别选的是PE和APC，PI和PE的还可以区分吗？学校的分选仪器是BD FACS AriaⅡ。

niwanmao

TMU-1107 发表于 2021-1-9 11:35
楼主，倪老师好，流式小白一个，目前也是想分选出某一细胞后做测序，请问用死活染料PI染细胞我看是不能洗， ...

如果是新鲜样本，并且是血样，一般不染死活染料问题也不大，因为活性有保障。
如果是组织样本，建议还是染一下死活。PI不要与PE一起用，你可以买商品化死活染料（像Live/dead、Zombie、Ghost等都可以有多种激发波长和发射波长可选）。

TMU-1107

niwanmao 发表于 2021-1-9 12:44
如果是新鲜样本，并且是血样，一般不染死活染料问题也不大，因为活性有保障。
如果是组织样本，建议还是 ...

嗷嗷，好的，谢谢倪老师。我们是组织样本，那就需要染一下了。还有一个问题是，我是两个Marker分选细胞，分组应该是①空白组②单染Marker-1③单染Marker-2④双染Marker1+2，这四组的前提是不是都是先染了死活染料，还有您提到的Zombie.我的Marker分别是PE和APC，那Zombie是不是选那个

UV是合适的,如果我着急用，能借到的是NIR，平行荧光素是APC/Cy7,这个会和Marker的APC串吗？谢谢您

niwanmao

TMU-1107 发表于 2021-1-9 13:44
嗷嗷，好的，谢谢倪老师。我们是组织样本，那就需要染一下了。还有一个问题是，我是两个Marker分选细胞， ...

补偿不可怕，都能调好。只要不重叠即可。

TMU-1107

niwanmao 发表于 2021-1-9 22:56
补偿不可怕，都能调好。只要不重叠即可。

谢谢您，倪老师