样品处理后，标记不上荧光

Yooooo

     如题，希望板块没有选错，第一次尝试做胞内蛋白检测，但是始终没有标记成功荧光。
     主要过程是加得到细胞悬液后，加细胞固定液室温固定10分钟，然后加0.1%triton室温孵育10min，加20μl 一抗（20μg/ml，母液稀释50倍）室温孵育30min，再加200μl稀释好的二抗（2mg/ml，稀释3000倍）4℃孵育30min，中间过程每次都用PBS清洗了两遍。以上是大致步骤，但是最终结果就是，最后的样品没有荧光，上机后，在目的荧光通道的峰很低（不知道这样描述准不准确），在荧光显微镜下观察，只有一两个细胞有荧光。所以想请教一下老师们，会不会是操作步骤哪里有问题，导致荧光没有标记上，比如二抗孵育时间过短，或者一抗就没有结合上？或者用什么方法可以验证我是哪一步有问题。
     一抗二抗的稀释浓度是来自抗体说明书的建议，孵育时间是来自抗体官网的protocol。

Yooooo

我自己有个想法就是，提高二抗的浓度，感觉一抗和二抗的浓度差距过大，然后增长一点孵育时间，改为1-2小时。

第一天的细胞没有标记成功，我在4℃放置过夜，第二天再用二抗标记一下，不知道可不可行。

tiger

Yooooo 发表于 2021-4-28 19:40
我自己有个想法就是，提高二抗的浓度，感觉一抗和二抗的浓度差距过大，然后增长一点孵育时间，改为1-2小时 ...

洗涤和抗体反应步骤都应含破膜剂。你再试试

Arial

中间洗涤过程不应使用PBS洗涤，应采用透膜液

niwanmao

1、你用了什么细胞固定液？浓度多少？
2、固定时间建议延长到15~20分钟。
3、固定之后，建议PBS洗涤1~2次。
4、Triton能破膜，但是不知道你是自己配制还是购买的，浓度很关键。如果仍无效，可适当提高。
5、建议胞内染色步骤，先用某个已知阳性的样本，先做性能验证，确保没问题之后，再去做这种未知的样本。

Yooooo

tiger 发表于 2021-4-29 09:14
洗涤和抗体反应步骤都应含破膜剂。你再试试

好的好的，谢谢。是直接用破膜剂稀释抗体吗？

Yooooo

Arial 发表于 2021-4-29 10:51
中间洗涤过程不应使用PBS洗涤，应采用透膜液

好的 ，谢谢。

Yooooo

niwanmao 发表于 2021-4-30 10:43
1、你用了什么细胞固定液？浓度多少？
2、固定时间建议延长到15~20分钟。
3、固定之后，建议PBS洗涤1~2次。 ...

细胞固定液应该没问题，是直接买好的，实验室做染色就是这种。
其余的我再试试。
还有，想问一下老师，验证细胞内部的蛋白（有的细胞有，有的细胞没有，结果的直方图是不是应该是两个峰啊，一个阳性，一个阴性？但是，我的结果就都是只有一个峰，那是不是可以认为这是阴性峰，因为这个目的蛋白据实验室其他人说，可能很难检测出来，表达量很少。）

tiger

Yooooo 发表于 2021-5-7 17:17
好的好的，谢谢。是直接用破膜剂稀释抗体吗？

破膜剂洗涤后，破膜剂100ul重悬，加入抗体就行了。

Yooooo

tiger 发表于 2021-5-7 17:29
破膜剂洗涤后，破膜剂100ul重悬，加入抗体就行了。

这个抗体是指稀释后的抗体吗？那这样不就相当于又把抗体稀释了？