血细胞加抗凝剂，再用Annexin V-PI检测凋亡

云木香

因为我做的样品是无脊椎的血淋巴细胞，血细胞本身十分容易凝集，所以在Annexin V-PI检测凋亡时操作步骤是1. 先加入了10% ACD抗凝剂，再用PBS重悬，300g 离心10min，PBS 清洗三遍


2. 接下去就是按照碧云天Annexin V-PI试剂盒操作

不知道加了抗凝剂有没有影响，因为抗凝剂就是去结合钙离子的？但是不加抗凝剂又没办法做，所有都是细胞团块。有没有更好的抗凝剂推荐？

而且我发现，加了抗凝剂之后，PBS重悬清洗清洗次数越多，尽管会损失大量细胞，但是细胞越容易分散为单细胞。

实在是做不下去了。

还有就是，从动物体上刚取下来的结缔组织，有没有好的方法能够分散到单细胞。我是用研磨棒轻轻研磨几下，然后用300目过滤，这样会得到的细胞多，但是碎片也很多。       胰酶试过了，几乎没效果，因为是组织块，都长死了。

niwanmao

抗凝剂你不是已经洗掉了吗？

至于组织的单细胞制备，可参考我们之前的帖子：
最完整的实体组织酶消化指导手册
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5834-1-1.html
(出处: 流式中文网)


可以酶消化结合研磨，研磨可用一下我们的魔滤，比研磨棒损伤小 https://kdt.im/PhQvsr。

云木香

niwanmao 发表于 2021-11-17 09:58
抗凝剂你不是已经洗掉了吗？

至于组织的单细胞制备，可参考我们之前的帖子：

好的，谢谢老师。
因为我做细胞凋亡和细胞ROS，如果研磨组织后再加入酶消化，会不会导致凋亡增加和ROS淬灭。而且我做的实验两次取样之间时间间隔较短，时间比较紧。
如果仅用研磨，300目过滤以后，保证去除大部分粘连细胞，在后面的流式细胞仪上再圈出单细胞，是不是可以省略酶消化这一步？

niwanmao

云木香 发表于 2021-11-20 19:25
好的，谢谢老师。
因为我做细胞凋亡和细胞ROS，如果研磨组织后再加入酶消化，会不会导致凋亡增加和ROS淬 ...

结缔组织不用胶原酶，光靠磨获得细胞十分困难。
酶是否会导致凋亡增加和ROS淬灭，我个人觉得看酶的组合和消化时间。
至于你所说的操作时间间隔较短、时间紧，这个都是可以通过实验合理安排做好的。

云木香

niwanmao 发表于 2021-11-21 08:51
结缔组织不用胶原酶，光靠磨获得细胞十分困难。
酶是否会导致凋亡增加和ROS淬灭，我个人觉得看酶的组合和 ...

好的。谢谢倪老师，我再去试试

qingfeng

niwanmao 发表于 2021-11-17 09:58
抗凝剂你不是已经洗掉了吗？

至于组织的单细胞制备，可参考我们之前的帖子：

倪老师，请问什么红细胞裂解液既能裂解红细胞，又能保留annexinV结合？ 因为裂红需要EDTA，annexin V需要二价阳离子，我近期有一个肝素诱导的凝血实验要求裂红后测血小板上ps外翻的程度，难搞

niwanmao

qingfeng 发表于 2022-3-4 10:54
倪老师，请问什么红细胞裂解液既能裂解红细胞，又能保留annexinV结合？ 因为裂红需要EDTA，annexin V需要 ...

先裂解红细胞，然后再进行annexin V染色。但是要关注是否会对血小板产生活化影响？

如果不裂解也是可以的，FSC和SSC用LOG，排除最高的那些白细胞、中间的红细胞，仅留最小的血小板即可。

qingfeng

谢谢谢谢