全血流式分析，先染色还是先裂红？

Climber

    血液流式分析对于临床和科研领域的Flower都是最为基础的工作内容，那么全血流式究竟是先裂红再染色还是先染色再裂红呢？根据本人最近看到的一些理论来看，先裂红和先固定都是可行的，但各有优缺点。
    首先谈谈裂红的影响，如果选择先裂红，需要考虑的是所需标记的抗原是否会受到溶血剂对其抗原性的影响，同时最好不要用含有固定剂的溶血剂，溶血剂在溶血完成后应当被彻底的洗去，以避免残留的溶血剂对抗原抗体结合的干扰。
    如果选择先标记，则需要注意反应的温度和时间，全血标本存在的补体系统可能会被抗原抗体的结合而活化，从而介导阳性细胞的溶解作用，因此如果多色方案含有在室温或37℃孵育的抗体此时是不合适的，抗体孵育的温度应维持4℃，同时时间在30min即可，时间太长也可导致阳性细胞的溶解。同时先染色需要考虑全血体积对抗体体系的稀释作用，需要提前计算好抗体的终浓度。
    总体而言，推荐是先染色后裂红，因为溶血剂是否干扰到目标抗原的抗原性是未知的，至于补体系统对阳性细胞的溶解，严格的控制时间和温度则可以有效规避补体系统的影响。
    关于红细胞裂解液：推荐使用Tris-NH₄Cl，配制方法为NH₄Cl 3.735g、Tris 1.3g、溶于500ml水中，0.22um过滤 4℃储存即可，使用时恢复至室温，温度较低的裂解液会导致裂解效果不佳。裂解液的使用用量可根据20ul 全血（这里以小鼠为例，人全血没做过）+500ul裂解液 室温裂解5min即可，如何判断裂解效果？实际上裂解液加入全血之后，吹匀可见液体整体呈现透明的深红色即为裂解效果良好，若为混浊不透明的红色则裂解不好，此时再加入500ul裂解液再观察效果。
   为何相同体积的全血需要不同量的裂解液？这可能是标本而采集时间、抗凝的效果有关。

niwanmao

小鼠可能用这个比较多。

人全血我一直用下面这个配方：
氯化铵裂解液储存液和缓冲液的配制
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-178-1-1.html
(出处: 流式中文网)



先裂红，主要是用于需要较多细胞的时候，裂红后可以浓缩，减少染色体积，从而减少抗体用量。一般氯化铵不太会对抗体结合有影响。

Climber

niwanmao 发表于 2022-7-23 13:55
小鼠可能用这个比较多。

人全血我一直用下面这个配方：

是的 目前我还只是做小鼠的流式，人源的标本我还没有接触到。目前先裂红和后裂红对我的结果几乎没有什么干扰

niwanmao

Climber 发表于 2022-7-23 14:19
是的 目前我还只是做小鼠的流式，人源的标本我还没有接触到。目前先裂红和后裂红对我的结果几乎没有什么 ...

感谢分享！

秦德猛

niwanmao 发表于 2022-7-23 13:55
小鼠可能用这个比较多。

人全血我一直用下面这个配方：

老师您好，我想问一下，如果是先染色再裂红，那全血中那么多细胞会不会影像抗体的染色效果？

niwanmao

秦德猛 发表于 2022-8-16 08:55
老师您好，我想问一下，如果是先染色再裂红，那全血中那么多细胞会不会影像抗体的染色效果？ ...

先裂解红细胞的情形适用于：
1、抗体可以结合红细胞时，为避免被大量结合，需先裂解。
2、需要大量白细胞时，先裂解，可以实现浓缩。


其它情形，先染色，不会影响抗体染色。

秦德猛

niwanmao 发表于 2022-8-16 09:20
先裂解红细胞的情形适用于：
1、抗体可以结合红细胞时，为避免被大量结合，需先裂解。
2、需要大量白细胞 ...

好的，好的。谢谢老师！

mikemaosi4396

niwanmao 发表于 2022-8-16 09:20
先裂解红细胞的情形适用于：
1、抗体可以结合红细胞时，为避免被大量结合，需先裂解。
2、需要大量白细胞 ...

老师，临床检验中，一般是先染色还是先裂解

niwanmao

mikemaosi4396 发表于 2024-4-17 16:46
老师，临床检验中，一般是先染色还是先裂解

通常先染色的（除了CD235a和CD41、CD61等特殊抗体之外）