Isotype的荧光值反而高？

steven

记得之前有帖子倪老师提到过在目标抗原微弱表达的时候，isotype的荧光值可能会比待测样本还高，造成无法划门。今天自己做流式就遇见了。


红色是Isotype，蓝色是待测的FAP。

FAP的表达应该是很低，或者几乎没有，所以出现这样的结果并不是太意外。
但是Isotype的荧光值似乎高的太多了，这样正常吗？（应该是没有加反试剂）

如果荧光值差不多，或者高一点我觉得应该是正常的，这样Isotype反而高4-5倍的情况有吗？
虽然听说过Isotype反而高的这种情况，但是自己没遇见过。第一次遇见就高这么多，不知道还算正常吗？大家都遇见过什么情况呢？

niwanmao

isotype不太容易匹配。
如果确保是匹配的，那么FAP应该是胞内标记吧，试一下破膜后，洗涤后Fc阻断，然后再洗涤，接着进行两者染色。

steven

niwanmao 发表于 2022-6-29 19:47
isotype不太容易匹配。
如果确保是匹配的，那么FAP应该是胞内标记吧，试一下破膜后，洗涤后Fc阻断，然后再 ...

isotype是同一maker推荐的，在和其他FAP阳性细胞一起进行流式分析时候匹配的挺好的，所以isotype本身应该问题不大。
FAP细胞表面和游离的都存在，我们这次是想分析表面的FAP表达情况，用的活细胞染色，所以不能固定破膜。
因为还做了其他的验证，PCR，WB，所以待测细胞应该是极少表达FAP没有问题。
但是isotype对照组荧光值高这么多常见吗？还是说确保操作没有问题的话，这个结果也是正常的？
感谢倪老师解答。

niwanmao

steven 发表于 2022-6-30 09:05
isotype是同一maker推荐的，在和其他FAP阳性细胞一起进行流式分析时候匹配的挺好的，所以isotype本身应该 ...

从这里描述的意思看，是以前用isotype设门都没问题，就最近这几个出问题？

steven

niwanmao 发表于 2022-6-30 21:09
从这里描述的意思看，是以前用isotype设门都没问题，就最近这几个出问题？ ...

之前都是FAP阳性细胞，所以用isotype设门的话，FAP+细胞荧光值都是高于isotype的，没看出来有什么问题。这次是FAP-细胞，竟然荧光值比isotype还低。

niwanmao

steven 发表于 2022-7-4 12:03
之前都是FAP阳性细胞，所以用isotype设门的话，FAP+细胞荧光值都是高于isotype的，没看出来有什么问题。 ...

这样的话，我倒觉得反而能证实了isotype设门不适合，更加说明了既往FAP+细胞比例偏低了。

改为Fc阻断设门吧。

steven

niwanmao 发表于 2022-7-4 13:20
这样的话，我倒觉得反而能证实了isotype设门不适合，更加说明了既往FAP+细胞比例偏低了。

改为Fc阻断设 ...

确实是啊，还没考虑到这个问题。
FC阻断的话，是control用FC blocker，然后待测样本用FC blocker+FAP 1stAb这个方案吗？

https://www.bio-rad-antibodies.c ... yCookieEnabled=true
刚才又读了一下Bio-rad厂商对isotype的说明，isotype可以确认观测到的荧光来自于抗体的特异性结合，但是不能用来界定阴性和阳性细胞，或者划门。这话该怎么理解啊？都确认了是特异性荧光了还不能划门？是因为有假阴性吗，就像我这次的这种，isotype实际造成了背景升高？

感谢倪老师解答，一直就对isotype这里的知识模模糊糊，正好有这个机会，想弄的明白点。

Jeffery_9

steven 发表于 2022-7-5 10:59
确实是啊，还没考虑到这个问题。
FC阻断的话，是control用FC blocker，然后待测样本用FC blocker+FAP 1st ...

楼主现在有答案吗？ 到底怎么判断是不是isotype抗体的问题呢

niwanmao

Jeffery_9 发表于 2022-11-8 17:11
楼主现在有答案吗？ 到底怎么判断是不是isotype抗体的问题呢

以前讲过类似的事情：

同型对照荧光比抗体强，咋办？阻断！
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5510-1-1.html
(出处: 流式中文网)

Jeffery_9

niwanmao 发表于 2022-11-9 07:35
以前讲过类似的事情：

同型对照荧光比抗体强，咋办？阻断！

倪老师，那BD的Human Fc block可以封闭mouse的细胞吗？ anti-mouse CD16/CD32 是不是排除不了CD64的影响？
谢谢！