CD3抗体在细胞刺激后，上机检测无信号，复染也没有染上，是什么原因？

JenniferLiu

各位好，

       请教一个问题，细胞在使用BD的刺激剂刺激5个小时以后，CD3的maker为什么会没有信号，可以很确定的是加了抗体的，而且破膜后复染也没有什么变化，自己也看了一些别人的经验，自己猜测会不会与CD3的克隆号有关，但是CD3做表面染色的时候，不刺激细胞，没有任何的问题，现在自己也不清楚是哪里的问题了，难道刺激之后CD3的maker内吞降解了吗？希望各位可以解答一下。多谢！

家的感觉

你应该用的anti-CD3+CD28刺激的吧，之前有学生用CD3刺激后再标记CD3抗体，流式确实检测不到CD3的阳性，可能和你说的克隆号、内吞有关，具体不清楚原因。其他多克隆刺激剂刺激后CD3可以标记呢，有经验的可以说说原因

悠游

你用CD3+CD28刺激的话，一般是先将CD3+CD28包被到板子上，然后加入细胞进行刺激，不然细胞上的CD3都会被占位，导致后续表染的CD3无法染上

CBJ

可能CD3位点被刺激剂占位或者封闭了，所以刺激后就检测不到了。应该加一个没有刺激剂的对照。

niwanmao

从既往的交流来看，一般建议不要使用相同的CD3抗体克隆进行刺激和检测，因为会有空间位阻或竞争性结合障碍。

一般说，如果用OKT3克隆号刺激，那么要用SK7克隆号检测，因为两者结合的虽然都是CD3ε，但是结合点不同，故可实现刺激后检测。

如果还是检测不到，也可以试试用不同物种（兔、山羊）的CD3抗体。

Yuck

niwanmao 发表于 2023-5-19 09:08
从既往的交流来看，一般建议不要使用相同的CD3抗体克隆进行刺激和检测，因为会有空间位阻或竞争性结合障碍 ...

谢谢老师

JenniferLiu

家的感觉 发表于 2023-5-19 08:42
你应该用的anti-CD3+CD28刺激的吧，之前有学生用CD3刺激后再标记CD3抗体，流式确实检测不到CD3的阳性，可能 ...

我不是使用的这种刺激方式，我使用的是BD的刺激剂，里面含有PMA，BFA，还有离子霉素的多克隆混合刺激剂。刺激了说明书上的五小时。

JenniferLiu

CBJ 发表于 2023-5-19 09:00
可能CD3位点被刺激剂占位或者封闭了，所以刺激后就检测不到了。应该加一个没有刺激剂的对照。 ...

我也怀疑过，我打算试试。

JenniferLiu

niwanmao 发表于 2023-5-19 09:08
从既往的交流来看，一般建议不要使用相同的CD3抗体克隆进行刺激和检测，因为会有空间位阻或竞争性结合障碍 ...

老师，你说的情况我明白，我也看了相关的帖子，你说的是在利用CD3和CD28共刺激的情况下进行后续检测时使用不同克隆好难的CD3抗体。我现在情况是我是直接使用BD购买的刺激剂进行刺激的。并且我看了对应试剂的说明书，里面是PMA，BFA，还有离子霉素的混合物，刺激五个小时后，CD3没有信号。

niwanmao

JenniferLiu 发表于 2023-5-23 13:09
老师，你说的情况我明白，我也看了相关的帖子，你说的是在利用CD3和CD28共刺激的情况下进行后续检测时使 ...

PMA+离子霉素+BFA刺激后，CD3不可能测不出的，应该是其它原因。