小鼠脾脏提取细胞上机流程和死活染色

痞子pz北

老师好，我需要提取不同处理小鼠脾脏细胞流式上机检测T、B、巨噬细胞比例变化，在提取完细胞后进行live/dead 染色，跑出来的结果好像没有活细胞，不知道是不是提取流程有问题，请各位做过的老师帮忙提提建议，谢谢

流程：1、取出脾脏，用冷PBS浸泡，使用冷PBS湿润过的魔滤对组织进行研磨，过筛
          2、将细胞悬液4度1000 rpm 离心5分钟
          3、加入5ml 氯化铵裂红液混匀细胞沉淀，静置2min
          4、4度 1000rpm 离心 5 min
          5、10ml 冷PBS 清洗一遍，再4度 1000 rpm 离心5 min
          6、用2ml 冷PBS重悬，计数，调整为10^7个/ml
          7、设置blank 管和live/dead 管，live/dead使用的是biolegend  Zombie Violet™ Fixable Viability Kit
            8、孵育15min后，用PBS清洗，离心后用400ul缓冲液重悬，上机
            9、结果如图所示


问题：1、是否提取出来的细胞全部都死了，所以阳性染色都染上去了
           2、提取流程是否有不妥之处，如何保证活细胞的得率
           3、后续还需要测Th、Treg和巨噬，应该都是需要确保活细胞才能检测到的吧
谢谢老师@niwanmao

不爱学习的木木

这个活性不是挺好的吗，右边那群才是死细胞阳性群吧

niwanmao

PB450是live/dead染料通道？这样看起来很不错了。

痞子pz北

不爱学习的木木 发表于 2022-9-30 16:48
这个活性不是挺好的吗，右边那群才是死细胞阳性群吧

第一次的图里，没有看到右边很明显的死细胞阳性群。
第二次的图里，强阳性的细胞群也只有一点点，所以不确定那里是不是死细胞。
因为有人告诉我细胞全部都是死的，所以才出现这样的结果了，我就分辨不了到底是什么情况了

痞子pz北

niwanmao 发表于 2022-9-30 19:22
PB450是live/dead染料通道？这样看起来很不错了。

PB450是live/dead 染料的通道

我就担心这个结果出现的是全阳性死细胞，所以重复了两次取样上机

后续TH和treg的染色都需要是活细胞才行，就不敢往下做了

niwanmao

痞子pz北 发表于 2022-10-4 16:12
PB450是live/dead 染料的通道

我就担心这个结果出现的是全阳性死细胞，所以重复了两次取样上机

你可能是误解了结果。第二次应该是最右侧的灰色峰才是真阳，是真的死细胞，而红色这个峰应该都是活的。blank用于设门是不对的。

痞子pz北

niwanmao 发表于 2022-10-4 19:05
你可能是误解了结果。第二次应该是最右侧的灰色峰才是真阳，是真的死细胞，而红色这个峰应该都是活的。bl ...

明白了，谢谢您啦

不爱学习的木木

痞子pz北 发表于 2022-10-4 16:10
第一次的图里，没有看到右边很明显的死细胞阳性群。
第二次的图里，强阳性的细胞群也只有一点点，所以不 ...

倪老师已经解答啦