PI和syto 9 细菌染色PI染不上

kuma1

老师们好，最近我在使用PI和syto 9染细菌，但是很奇怪pi流式出来一直没有信号，用抗生素处理的阳性组也是没有信号

而且我的数据很奇怪都是像镰刀一样的形状，补偿调的时候数据也是很奇怪

kuma1

各位老师我发现改变门的位置，好像数据显示就正常一点了，我之前觉得细菌很小，然后看起来左下角那一坨最多，习惯把所有的都圈起来，是不是就是不行，我现在这么圈舍弃了一大部分细菌，是不是才是对的呢

niwanmao

kuma1 发表于 2022-12-13 17:36
各位老师我发现改变门的位置，好像数据显示就正常一点了，我之前觉得细菌很小，然后看起来左下角那一坨最多 ...

在机器自带软件上图形什么样子？看起来Flowjo对你的仪器数据兼容性不够好。

kuma1

niwanmao 发表于 2022-12-13 19:57
在机器自带软件上图形什么样子？看起来Flowjo对你的仪器数据兼容性不够好。
...

自带软件上会正常很多，但是pi单染任然显示没染上

老师像这种不兼容的情况我应该怎么办呢

niwanmao

kuma1 发表于 2022-12-13 20:13
自带软件上会正常很多，但是pi单染任然显示没染上

老师像这种不兼容的情况我应该怎么办呢

不兼容可以通过调节Flowjo的参数，坐标轴边上那个T字按钮实现兼容。

但关键确实在于你的PI没有阳性信号，是真的细菌没有死亡？还是PI浓度或染色问题？

kuma1

niwanmao 发表于 2022-12-13 21:12
不兼容可以通过调节Flowjo的参数，坐标轴边上那个T字按钮实现兼容。

但关键确实在于你的PI没有阳性信号 ...

细菌应该是死了的 我之前拿75%酒精作为阳性对照也试过，pi也是没染上
浓度的话 我按说明书来的，已经是说明书上最大得浓度了，我再把浓度调大做个梯度实验试试

niwanmao

kuma1 发表于 2022-12-13 21:38
细菌应该是死了的 我之前拿75%酒精作为阳性对照也试过，pi也是没染上
浓度的话 我按说明书来的，已经是 ...

先按说明书的浓度，把电压先调大再看看

wxd

有没有可能是你没收到细菌。普通的流式细胞仪检测细菌，需要调整FSC-H阈值。并且在分析的时候，把FSC和SSC坐标轴调整为对数以便圈出细菌群体。

kuma1

wxd 发表于 2022-12-14 08:32
有没有可能是你没收到细菌。普通的流式细胞仪检测细菌，需要调整FSC-H阈值。并且在分析的时候，把FSC和SSC ...

但是老师我的syto是有信号的 这样也可能是没收到细菌吗
哦！是不是我只收到了活细菌 但是死细菌因为太小我没收到，所以pi一直没颜色呢

如果调整FSC-H的值 老师您的经验值一般是多少呀，或者怎么看到了合适的值呢？
谢谢老师您了！

kuma1

niwanmao 发表于 2022-12-13 22:25
先按说明书的浓度，把电压先调大再看看

老师您好 我今天拿抗生素模拟了一下死细胞单纯染pi的实验，做了一个pi梯度变化 任然是没有收集到pi的信号，即便我增大电压也只是变成空白组（无染料）和实验组信号共同增大。

其实我之前做过染料染细胞在共聚焦下面看的实验，同样的染色方法共聚焦下是能看到红色的，所以我非常疑惑
刚刚看到了wxd老师说的话 我觉得很有道理，有没有可能是因为我没有调阈值，所以我只收集到了活细胞，死细菌太小了我没收集到所以没有pi值呢，目前我们仪器默认的阈值时fsc5000