向大家求助经检测比较可靠的肿瘤细胞周期检测protocol

vetzcm

论坛的各位朋友，谁手中有正在使用的检测细胞周期的细胞处理和染色的实验步骤啊？包括所用试剂及浓度，配方等，总之，越详细准确越好，可不可以给我一份作为实验的参考方法。最近按照一个网上的实验方案，加完RNAase 37度水浴后，细胞就结成团块了，离心后加入PI染液，细胞根本吹打不散，以致无法上机检测啦！或者谁可以告诉我，去哪里可以找到比较权威的细胞周期检测实验技术方案，不胜感激！

niwanmao

protocol见：http://www.flowcyto.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=1330
你怎么会在37度水浴呢？看来随便找来的protocol真是害人。
在整个过程中，应该是去除RNAse中的DNAse需要煮沸，其它都是在常温避光条件下进行的。

流式中文网的protocol库的建立还是必要的（http://www.flowcyto.cn/forum.php ... ypeid&typeid=35），希望大家群策群力，贡献出自己手头真实可用的protocol来吧，造福FLOWER。

stef1981

以前我们也是37度水浴，多半都会成团，后来就不水浴了，常温就行了

vetzcm

stef1981 发表于 2012-2-14 10:54

                               
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以前我们也是37度水浴，多半都会成团，后来就不水浴了，常温就行了

谢谢，决定按倪老师的步骤做了

gcz5340

倪老师给的链接我权限还不够看不了，细胞周期的protocol见过很多，不过我觉得37度孵育是有道理的啊，一般酶最适作用温度就是37度啊。我觉得楼主细胞结团和水浴没有关系，首先细胞量要控制好，固定的时候要尽量吹匀，其次孵育的时候也应该多拿出来混匀，如果上机前还是有团块需要过滤后上机。

niwanmao

gcz5340 发表于 2012-2-15 22:53

                               
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倪老师给的链接我权限还不够看不了，细胞周期的protocol见过很多，不过我觉得37度孵育是有道理的啊，一般酶 ...

感谢参与讨论，上次你通过实名验证由于未申请加分，所以未及时升级到注册会员，现已给以50颗流星实名奖励，可以查看所有的资料了。

很高兴大家能够参与讨论，讨论才能出真知。

我谈谈我的观点：
1、我们平时做pcr时酶的最佳作用温度不是37度，而是更高的温度（例如RNAse的最佳活化温度是60度），所以这37度应该是根据以前所说的抗体孵育温度推测的，不知道这个protocol是哪里来的，是哪一年出的。所以，这温度是否有依据？
2、细胞经过乙醇固定之后，细胞膜本身渗透性增高（就象另一个帖子中所说的，需要预先用PFA固定后才能防止GFP渗漏），如果放到37度水浴，细胞从低温到37度，正常细胞当然没问题，但这些细胞本身就被固定过，脆性很高，我觉得很可能会因此进一步造成细胞破坏。平时我们在常温下处理的时候，都能看到少量成团，最后需要过滤。

niwanmao

niwanmao 发表于 2012-2-16 09:01

                               
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感谢参与讨论，上次你通过实名验证由于未申请加分，所以未及时升级到注册会员，现已给以50颗流星实名奖励 ...

真是奇怪了。这个从专业书籍中摘录的protocol还真是用37度水浴来孵育PI：http://www.flowcyto.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=1331

我从来没试过用37度水浴，请试过的朋友来谈谈看，我们统计一下，水浴的成功率和常温的成功率哪个更高。

vetzcm

gcz5340 发表于 2012-2-15 22:53

                               
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倪老师给的链接我权限还不够看不了，细胞周期的protocol见过很多，不过我觉得37度孵育是有道理的啊，一般酶 ...

您说的一些注意点是该让我考虑下....我做实验，用六孔板培养细胞，加药处理后，用1.5ml离心管收集细胞进行实验。或许真的与细胞量有关，可能细胞数多了！！！现将我做的实验步骤贴出来，供大家批判吧！

（1）收集对照及处理组细胞，PBS洗2次，胰酶消化，1ml 培养液终止，1000rpm离心5min后，将细胞重悬于PBS中，调整细胞浓度为1×106个/ml。（我没有计数，凭经验就是一孔细胞，1mlPBS，是不是做实验用1*106个细胞总数就够了呢？）
（2）PBS洗2次，留取少量PBS，轻轻吹吸混匀。
（3）向细胞悬液中慢慢滴加1ml预冷的70％乙醇，边滴边轻弹管壁使细胞与乙醇充分接触，4℃固定过夜。
（4）1000rpm离心5min，弃去固定液，PBS洗2次。
（5）加入500μl含100μg/ml RNase A 的PBS，吹吸混匀后37℃水浴30min。
（6）加入500μl含50μg/ml PI的PBS，吹吸混匀后4℃避光孵育30min。
（7）调整细胞密度（调整步骤真的有必要吗？），上机检测。

niwanmao

vetzcm 发表于 2012-2-17 12:00

                               
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您说的一些注意点是该让我考虑下....我做实验，用六孔板培养细胞，加药处理后，用1.5ml离心管收集细胞进 ...

其它问题不大，但第5、6步中的PI和RNAse我是合在一起，跟TRITON X 100配成工作液，一起加入，常温孵育：http://www.flowcyto.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=1330

最后一步调整细胞密度可以凭经验调节，获取时最好以低速获取。

470913706

常温和37℃水浴都做过，感觉水浴是比较容易成图，后来就改成常温了，两者结果没见明显差别