请教大家，为何双阳性这么多呢？

CRP

请教大家，我的实验数据里面双阳性部分很多，我的细胞是mouse脾脏，经过分选的Naive T细胞，然后再anti-CD3和anti-CD28的刺激下诱导分化，就是不理解为何双阳性的细胞为何这么多，而且在对照和刺激条件下都很多，个人感觉是anti-CD3和anti-CD28造成的，但是文献上都是没有这一部分的。

niwanmao

你将这堆双阳性的细胞圈中，然后反过来看它在FSC/SSC点图上位于哪个位置

CRP

niwanmao 发表于 2012-10-23 10:45

                               
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你将这堆双阳性的细胞圈中，然后反过来看它在FSC/SSC点图上位于哪个位置

应该是在CD4的区域，FSC/SSC点图上，还是相对集中的，没有什么可疑的地方，另外我的细胞也是分选的纯细胞，应该不会有其他CD4细胞，另外我的细胞分化时间时间比较久，细胞形态变化很大，但是不是很均一，所以CD4的区域是比较大的，但是双阳性的区域在CD4上是均匀分布的，没有位置上的特殊

我是先圈一个CD4，然后再分析其IL-4和IFN-gamma的

niwanmao

CRP 发表于 2012-10-23 11:03

                               
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应该是在CD4的区域，FSC/SSC点图上，还是相对集中的，没有什么可疑的地方，另外我的细胞也是分选的纯细胞 ...

那么碎片肯定是可以排除了，但是死细胞或凋亡细胞还是难以排除的，我们在临床标本中有时候碰到标本质量差的标本，有时也会出现一些非常高的非特异性染色。
建议：如果有可能，最好加上7-AAD，作为排除死细胞的依据，http://bio.lonza.com/fileadmin/g ... zed_Protocol_73.pdf  这篇protocol是关于核酸转染的，他也是做T细胞的刺激，用PI排除死细胞，因为用抗体刺激这么多天，而且组织研磨解离，是可能会导致一些死细胞

CRP

niwanmao 发表于 2012-10-23 14:37

                               
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那么碎片肯定是可以排除了，但是死细胞或凋亡细胞还是难以排除的，我们在临床标本中有时候碰到标本质量差 ...

应该也不是非特异性染色，我的同型对照都是没有这部分的

死细胞的话，我就崩溃了，没道理啊，这么多，而且我做的CD4+ t细胞的结果是没有这部分的双阳性的，只有这种Naive T用了anti-CD3/28刺激，才出现这么多的双阳性，而且我看文献报道是anti-CD3/28是可以诱导细胞向Th0分化的，和我的很相似，但是我不明白这个TH0是否是可以流式检测得到？

niwanmao

CRP 发表于 2012-10-23 15:25

                               
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应该也不是非特异性染色，我的同型对照都是没有这部分的

死细胞的话，我就崩溃了，没道理啊，这么多，而 ...

那么你下次可以这样验证一下：
抽取几管可疑的，在上机前，取一滴做台盼蓝染色看细胞活力，简便、经济

nsync4

Th0细胞就是同时表达IFN-r和IL-4的。只是你的双阳性的结果像是非特异性背景，我们做过PMA和离子霉素刺激后的，双阳性细胞比较致密均一。