小鼠脾脏B淋巴细胞分选，求老前辈们给予经验帮助

續、寫。

因为本校的流式分选仪器相对老化，所以要花1个小时左右车程去外面做分选，因为第一次做细胞分选{:soso_e134:}，有很多细节问题求前辈们解答，谢谢{:soso_e183:}。

1.有没有什么方法取脾细胞能够减少细胞碎片，我得做法不是研磨，我是把脾脏细胞刮下来的（我觉得研磨会更伤细胞）

2.我用的流抗是常规的（含有防腐剂叠氮钠），还有要区分死细胞，要使用7-AAD，这些因素会影响细胞活性吗？

3.听有些前辈说，分离到脾脏细胞到分选的整个过程，都要把细胞放在冰面上，这样有利于提高细胞活性，不知道是不是这样？

4.做流式常规检测时，我的流抗染色用的介质是：PBS+0.5%BSA（确实能提高活性），但是做分选染色是不是只能用PBS，或者有其他的染色介质代替？

5.用的是BD的流式抗体，用量是个问题，我的做法是做一下抗体的滴度，比如5×10^5个细胞用0.1ug的抗体量（BD流抗一般0.2mg/ml，即用0.5ul），因为要分选的细胞数多（大概要用1×10^8），按这样算要100ul流抗，感觉心在滴血{:soso_e101:}，前辈们是怎么计算抗体用量的？

5.在我染完色之后，样品带过去的途中，使用PBS好呢？还是用培养基好呢？（用培养基的话，去到做分选的地方应该要重新洗涤）

6.分选完毕要把细胞带回来继续培养，听说分选出来细胞最好用高浓度血清的培养基（浓度未知？），或者有没有更好的方法把细胞带回来？

7.还有什么要经验可以有助于分选的，希望前辈们指出来，谢谢大家。

niwanmao

1、实体组织制备成悬浮细胞无论何种方法都会产生碎片，至于机械研磨碎片多还是消化法碎片多，可以自己摸索一下，可能没有绝对的。

2、可以用7-AAD，但是不要和其它抗体的荧光通道重叠

3、尽量冰上操作，这是事实。

4、可以用PBS+BSA的啊。

5、不是完全跟数量成正比的，体积为主，体积如果仍然是100μL，那么只要适当加几倍即可。

6、1个小时的话，感觉是不是在那边染色更好？实在不行，用PBS+BSA重悬放在冰上应该问题不是很大。

7、用50％BSA的培养基。

8、走一步看一步

續、寫。

niwanmao 发表于 2015-7-23 20:06
1、实体组织制备成悬浮细胞无论何种方法都会产生碎片，至于机械研磨碎片多还是消化法碎片多，可以自己摸索 ...

谢谢倪老师，不知道老师的BSA是不是可以用血清（FBS）替换，因为BSA外用的，有菌。

niwanmao

續、寫。 发表于 2015-7-24 14:24
谢谢倪老师，不知道老师的BSA是不是可以用血清（FBS）替换，因为BSA外用的，有菌。 ...

可以的。