PBMC检测淋巴细胞亚组比例的疑惑

shushuangshuang

（1）提取外周血PBMC，CD3/CD28刺激后，流式检淋巴细胞比例，如图：
图1-4采用相同的PBMC提取方法，CD3/CD28刺激时间及浓度一样，为什么淋巴细胞分布不同？图2中哪群才是淋巴细胞？刺激后淋巴细胞变大，是不是只有图4淋巴细胞圈门才是最准确的？图1是不是有太多死细胞及细胞碎片？图3淋巴细胞圈门是否正确？谢谢各位。

分析图

niwanmao

培养过之后，往往会伴有很多细胞碎片，建议可以用淋巴细胞相关标记反设门，或者加一个CD45，就很容易将淋巴细胞圈出来。

shushuangshuang

niwanmao 发表于 2016-1-18 22:11
培养过之后，往往会伴有很多细胞碎片，建议可以用淋巴细胞相关标记反设门，或者加一个CD45，就很容易将淋巴 ...

那老师，为什么有的时候细胞碎片多有的时候少呢？图4就分的很少，细胞碎片多了，会影响我后面的分析的。我是检测CD4+CXCR5+ICOS+在CD4+中的比例。如图CD4+设十字门，检测CXCR5+ICOS+细胞的比例。可是结果时好时坏，细胞碎片多了，CXCR5+非特异结合就很多，最后三标的细胞比例也很少，是我没刺激起来吗？谢谢您，能帮我看下这次检测结果问题出在哪里吗？图1是设淋巴细胞门，图2是圈出CD4+的细胞，图3是单加CD4+抗体设十字门，右下角3.21是非特异结合，图4是3种抗体都加的，右上角3.28细胞比例太低。。

shushuangshuang

niwanmao 发表于 2016-1-18 22:11
培养过之后，往往会伴有很多细胞碎片，建议可以用淋巴细胞相关标记反设门，或者加一个CD45，就很容易将淋巴 ...

老师，有什么方法可以减少碎片吗？第一次图中图4细胞碎片就很少，可是别的标本的操作步骤是一样的，不知道为什么细胞碎片就多了很多。。第一次中图2都几乎圈不出淋巴细胞了，每次操作步骤都一样的啊，我不知道结果为什么变异很大。谢谢您！

niwanmao

shushuangshuang 发表于 2016-1-18 23:44
老师，有什么方法可以减少碎片吗？第一次图中图4细胞碎片就很少，可是别的标本的操作步骤是一样的，不知 ...

实验就是如此。你自己觉得每一步都一样，其实可能其中哪一步细节出了问题，或者标本批次不同活力状态也不同，都是影响最终结果的。

我的建议前面也说了，这里重申并补充一个解决方案，下面多选一：
1、加上细胞死活鉴别染料（例如live/dead或其它死活鉴别染料）；
2、加上CD7；
3、加上CD45；

祝顺利！