关于细胞分群的问题

Brian111

各位好，想向大家请教一个问题：为什么流式检测中，有的细胞染色后分为明显两群，而有的却是整体偏移呢？

先说说我自己的一点理解，首先我认为这是和要检测的抗原性质有关（以检测表面抗原为例），比如cd3就是明显的两群，这可能是由于T细胞表达cd3全或无的属性决定的。而另外一些，比如pd1，cd25等，在流式结果中就是拖拖拉拉一大片，没有明显分界。其次，我认为和仪器分辨率也有关系。比如说不表达的细胞为0，而表达的有1,2,3（单位），在分辨率为1的情况下，可能它就是连续的。但如果分辨率是0.1，也许就能明显分开了。当然这是笼统的一个解释，可能还涉及线性或者指数放大之类的。不知以上我的理解是否正确？

再有就是我的一个疑惑了，我们在做cart的相关研究，之前检测car是通过其自带的gfp。最近换了种方法，就是用抗体检测。可是gfp的结果是细胞分为明显2群，可是抗体染色后，细胞只是向阳性区偏移了，并没有分群。可是car的表达本身也是可以分群的，这是我们之前有过的经验。那么为什么会出现如上的问题呢？我们进行染色的样本是同一样本，所以可以排除样本间差异。另外补偿也是做的，不会是补偿原因。

叙述可能不成章法，各位海涵，谢谢大家！

niwanmao

表达的分群好坏，现实情况下，与三个因素有关：
1、抗原表达量。
2、使用的荧光素。
3、抗体滴度。

CD3之所以分群这么好，是因为表达CD3的T细胞，其表面CD3分子数量很多，多到与粒细胞、B细胞、NK细胞等不表达CD3的细胞产生了极大的差异。并非是T细胞表达CD3全或无，T细胞肯定是表达CD3的，而且是高表达。

至于分辨率，这个倒是不存在这个事情。

你提到的CART 本身GFP分群好，加了抗体之后分群不清，那么我认为就存在以下问题可能：
1、抗体的特异性问题，可能存在明显的非特异性结合，导致分群不好。
2、抗体的荧光素和滴度是否恰当。
转染GFP的细胞，我不明白为什么不用这么好的GFP，而偏偏要画蛇添足增加抗体染色呢？

Brian111

niwanmao 发表于 2017-6-7 10:54
表达的分群好坏，现实情况下，与三个因素有关：
1、抗原表达量。
2、使用的荧光素。

谢谢回复！抗体滴度我们之前是检测过的，不过比较久了。但是我认为这个可能不是重要的原因，因为我们用这个条件做过比较多的实验了，检测结果也是分群的。目前换了个新的细胞，用同样条件就不分群。所以我认为，即使与抗体有关，可能也不是最关键的吧？

另外，您提到的为什么有gfp还要用抗体，我倒并不认为是画蛇添足。首先，在将来的实验中会将gfp去掉，这一点我刚才没有提到。那之后的检测可能还是会通过流式。所以我们也想比对一下抗体染色和gfp表达有多少差别。其次，gfp表达不一定代表car的表达，即使他们在同一个启动子下，效率也是不一样的。我们流式结果也证明了这一点。

我在想会不会是不同的car序列造成它在细胞的表达情况是有差异的？还是说一定是因为检测方法不能忠实反应它的表达？

再次感谢您的回复！

niwanmao

Brian111 发表于 2017-6-7 11:45
谢谢回复！抗体滴度我们之前是检测过的，不过比较久了。但是我认为这个可能不是重要的原因，因为我们用这 ...

了解了。那我觉得还是应该用CAR特异性的抗体去检测，而不应该是GFP抗体。

Brian111

您说的非常对，不过目前做特异性抗体比较贵，而且周期很长，所以目前不考虑。而且我们不是抗gfp，而是抗膜表面的另一个东西，虽说不能做到很好的特异性，但是从结果来看，和gfp趋势是一致的。我个人感觉，从原理上来说，应该比gfp更准确一些吧。谢谢！