流式染色细胞固定破膜后再染表现marker可以么

yxzxlmlf

RT，一定要先染完表面marker后固定破膜再染胞内因子吗？可不可以固定破膜后胞外胞内一起染色？比如PMA诱导完淋巴细胞后CD4会降低，所以倪老师的一个帖子里http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-6801-1-1.html介绍说可以CD4固定破膜后再染，才有此疑问。流式小白请教大家，谢谢！

niwanmao

1、可以，但是要摸索，因为有些表面标记被固定之后，可能构象发生改变，就结合不上了。
2、那个帖子里面，之所以推荐试试固定破膜后再染，并不是针对表面，而是因为可能CD4在刺激之后发生部分内化，所以破膜之后能使其充分暴露，容易被测到。大概这样的思路。

yxzxlmlf

niwanmao 发表于 2018-8-2 09:32
1、可以，但是要摸索，因为有些表面标记被固定之后，可能构象发生改变，就结合不上了。
2、那个帖子里面， ...

谢谢倪老师！除了CD4，其他的CD分子还是先染后固定的，我试了下CD4固定破膜后再染，还行，可以染上，阴阳分群明显

niwanmao

yxzxlmlf 发表于 2018-8-3 09:23
谢谢倪老师！除了CD4，其他的CD分子还是先染后固定的，我试了下CD4固定破膜后再染，还行，可以染上，阴阳 ...

是的，PMA刺激后，主要是对CD4影响。

wjd850801

请问一下，一般细胞固定和破膜，试剂的浓度、作用时间和温度，如何确定

niwanmao

wjd850801 发表于 2019-10-24 13:35
请问一下，一般细胞固定和破膜，试剂的浓度、作用时间和温度，如何确定

商品化试剂都有说明书的。

wjd850801

niwanmao 发表于 2019-10-25 07:47
商品化试剂都有说明书的。

谢谢倪老师

gaga1989xl

在文献上看到CD69也推荐破膜后再染(CD69 is up-regulated on T cells within 6 hr of activation. Antigen-specific cytokine detection can be enhanced by demonstrating the coexpression of CD69 and the cytokine(s) of interest (Waldrop etal., 1997). The anti-CD69 MAb is typically added during the intracellular staining step, as secretion inhibitors such as BFA will prevent the surface expression of the newly produced CD69 protein.
)。另外：请教各位战友，是否遇到PMA刺激后CD3表达降低分群不明显的？如何解决，也是破膜后染吗？

niwanmao

gaga1989xl 发表于 2019-11-5 10:00
在文献上看到CD69也推荐破膜后再染(CD69 is up-regulated on T cells within 6 hr of activation. Antigen- ...

CD3不会的。

wjd850801

niwanmao 发表于 2019-10-25 07:47
商品化试剂都有说明书的。

倪老师，还有个问题想请教一下，当我们开发一个新方法时，涉及到的参数如果没有质控，如何做方法学验证中的准确度一项呢