精子细胞

yangzhaiping123

老师，您好，在附件中有两幅流式PDF图片，其中，

A为2n精子，按理论在B图中应该出现三个峰，即第一个峰是类似于A的一个峰，第二个为图中出现的峰，第三个峰是位于大约是第二个峰值的2倍，即三个峰的峰值比为：1：1.5：3.

现在我想问的问题是：在图B中只出现了1.5倍峰，是否存在1.5倍这个主峰掩盖了第一个和第三个峰，或者如何解释这种现象？

   谢谢老师作答！

补充：1倍峰和3倍峰占的比例很小，大约均占总体的10%左右。

niwanmao

下面这两张图是根据你上传的源文件做的，我看了之后，总体感觉如下：
1、FSC为什么这么小，是没调出来还是因为细胞碎片的原因？
2、如果FSC-SSC全部都是正常精子细胞，那么PI分析应该是可用的。

细胞周期

我认为你的A、B两个标本的第一个峰应该是同一个（都是1倍体峰），因为以前他们研究生处理标本的时候出现过这类情况，就是没有调节细胞密度，全部使用一样量的PI，结果就导致细胞多的那个标本PI荧光偏弱，而细胞少的那个标本PI荧光偏高（当然，这是在两个标本细胞数量相差较大的情况下）。所以，我觉得你的B标本的第1个峰发生向右偏移可能跟细胞数量偏少，而加的PI量一样有关。
解决方法：如果A标本为标准，那么你可以设置三个标本（A、A+B、B），这样，中间那个A+B标本可以用来确定两个标本的第1个峰是不是都是1倍体峰：如果B的第1个峰是1倍体峰，那么A+B标本中的第1个峰应该跟B标本的第1个峰重叠；如果B的第1个峰是1.5倍体峰，那么A+B混合标本中会比B标本中多出一个独立的1倍体峰。

stef1981

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感觉B图中的主峰也是属于1倍峰，2、3倍峰都没有出来，可能是因为细胞浓度、染料浓度的差别导致的主峰位置的偏差。
按理说A、B图中都应该有1、2、3倍峰的存在，可能是染色不够充分，或者细胞聚集碎片过多的原因造成的
看看你的PI-A/PI-W图就知道原因了

   

yangzhaiping123

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好的，谢谢！:)


   

yangzhaiping123

回复 stef1981 的帖子我把PI图发上来了，望您指导！谢谢老师！
补充:A图为对照组 B为实验组，以A组相同的电压对B组进行收集细胞。


   

stef1981

可能还是染色的问题，单倍体、多倍体没有分开，我们做的都能分成独立的细胞群

niwanmao

可能还是染色的问题，单倍体、多倍体没有分开，我们做的都能分成独立的细胞群 ...
stef1981 发表于 2010-11-28 14:54

                               
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估计精子比较脆弱，也可能在进行PI染色之前的破膜时，可能细胞受到比较大的破坏了。
还是使用商业化的试剂盒，破膜方法比较温柔一点。

stef1981

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就用75%的乙醇固定就行了，PI也是自己买的干粉配的，感觉很简单。结果不好还是操作步骤上的原因

   

yangzhaiping123

回复 stef1981 的帖子PI是自己配的，终浓度为10 ug/ml；精子是用70%乙醇固定的，谢谢指导！:)


   

yangzhaiping123

回复 niwanmao 的帖子谢谢倪老师帮忙分析！