正常胃黏膜/胃癌组织消化后跑流式，遇到好多问题，求助

despacito

求助各位老师：
1、我的消化方案是：临床取得标本后，立刻置入装有5ml HBSS液的15ml离心管中，随后在冰盒中运输并在40min内进行处理。首先，称重后立刻置入含3ml RPMI 1640无血清培养基中，眼科剪剪碎至1-2mm大小；随后将体系移入含有1.7ml RPMI 1640以及1 test的美天旎tumor dissociator kit体系中，用美天旎配套的组织研磨仪研磨后，立刻置入37℃摇床中孵育1h（中间于0.5h时取出再研磨一次），再次研磨后置于70μm滤器中过滤，10ml RPMI-1640轻轻冲洗滤器，4℃下1500rpm离心8min，弃上清PBS重悬，1200rpm离心5min，得到细胞。
但最终还是发现终产物有不少的丝状物或絮状物，上机后直接堵住流式仪器，非常麻烦。后来采用的方案是在滤过后再次换新的滤器滤一次，效果仍不理想。想听听看老师们的意见，这些丝状物是什么？是死细胞产生的DNA吗？怎么样能去除这些物质？
2、目前的流式染色方案是：CD3-APC, PE-CD45, FITC-CD14, PERCP-CD4/CD8，PERCP这个通道的染色效果一直很差。上图：
（对照未染、PERCP-CD4、PERCP-CD8）

之前是因为分不开群，所以觉得这个可能有问题，后来按照老师的建议做了空白对照（同型对照没抗体，尴尬），做出来发现对照组在这个通道上也能检测得到荧光……是细胞的自发荧光吗？如何解决这个问题？

课题至今已经三个月了，做出这种东西实在让人非常焦虑，救救孩子吧……

niwanmao

我不太清楚美天旎tumor dissociator kit的酶成份是什么，但是消化1小时，会不会有点长？我建议你消化10~15分钟之后，就拿出来直接研磨并过滤。也可以试试我们网站的魔滤+魔杵研磨（塑料做的，比金属刀片相对柔和很多）。

从你描述的结果（丝状物、絮状物）来看，很可能是细胞消化死了或磨坏了，所以导致最后的染色结果也都是假阳性。

despacito

niwanmao 发表于 2019-12-21 19:36
我不太清楚美天旎tumor dissociator kit的酶成份是什么，但是消化1小时，会不会有点长？我建议你消化10~15 ...

这些步骤都是按照试剂盒上建议的步骤来的，他的研磨耗材本身也是塑料制品，也许下次我们可以尝试一下减少研磨次数和消化时间再行对比

这个是我用相同抗体染PBMC得到的结果，PBMC就是采血后HBSS稀释一倍加到Ficoll上减速离心得到的，CD4用的量是1test(5μl)，感觉分群也分得不开啊，您觉得这个CD4抗体还推荐使用吗

niwanmao

despacito 发表于 2019-12-23 11:10
这些步骤都是按照试剂盒上建议的步骤来的，他的研磨耗材本身也是塑料制品，也许下次我们可以尝试一下减少 ...

分群能力不太好。一般我们CD4做出来分得很开的。

despacito

niwanmao 发表于 2019-12-23 11:29
分群能力不太好。一般我们CD4做出来分得很开的。

更换荧光标记是否好一些？还是这本身与我实验处理有关系？

niwanmao

despacito 发表于 2019-12-23 14:41
更换荧光标记是否好一些？还是这本身与我实验处理有关系？

一般即使最弱的FITC也不至于这样。你的实验步骤里面裂解液是不是含固定成份？

despacito

niwanmao 发表于 2019-12-23 17:54
一般即使最弱的FITC也不至于这样。你的实验步骤里面裂解液是不是含固定成份？ ...

没有。然后之前染过7-AAD，死细胞不多，6%

niwanmao

despacito 发表于 2019-12-24 22:33
没有。然后之前染过7-AAD，死细胞不多，6%

先用外周血进行一下CD4抗体的滴定，找出最佳用量，然后再做组织样本。
如果用最佳用量还是如此，说明确实抗体质量欠佳。但做还是能做。