求教流式染色后为什么没有还是只有一个峰

wsjheaven

liuruiluna 发表于 2020-11-23 10:48
FSC/SSC的图最好也发上来看看

这是fsc和ssc的图片，谢谢了

wsjheaven

niwanmao 发表于 2020-11-20 20:09
小鼠细胞小，可能需要增加离心力，否则容易丢失。
细胞量的话，表面和胞内差异不大。你上面说分不开，是胞 ...

刚看了您之前发的关于抗体的帖子，确实在做的过程中，因为洗涤后没有弃干净的液体，所以可能最终染色的时候，体积不是100ul，而可能是200ul，但是我的抗体还是按100ul加的。所以会不会这种情况会影响染色结果？

其次，想问一下，我在记录结果的时候，大概一次计数多少个细胞的结果就比较有说服力了呢？谢谢倪老师

niwanmao

wsjheaven 发表于 2020-11-23 12:09
刚看了您之前发的关于抗体的帖子，确实在做的过程中，因为洗涤后没有弃干净的液体，所以可能最终染色的时 ...

体积不正确，会影响染色效果，因此重悬之后，需要用枪头再重新评估一下体积。而不是主观感觉。

记录结果时，根据细胞比例而定，如果细胞比例在1％以上，有效细胞1万左右即可。如果在1％以下，尤其是0.1％以下，尽量在10万甚至更多。

陈景飞

niwanmao 发表于 2020-11-23 14:49
体积不正确，会影响染色效果，因此重悬之后，需要用枪头再重新评估一下体积。而不是主观感觉。

记录结果 ...

倪老师，小鼠细胞增加离心力，是可以增加到多少？我一般用300g, 5分钟离心，但总觉得细胞没有完全沉淀下来，稍微一晃动tube,就发现有些细胞飘起来了。但是又害怕增加离心力，会增加细胞的死亡。谢谢倪老师！

wsjheaven

niwanmao 发表于 2020-11-23 14:49
体积不正确，会影响染色效果，因此重悬之后，需要用枪头再重新评估一下体积。而不是主观感觉。

记录结果 ...

倪老师，想请教一下，我用死活染料染色（thermo的live/dead NIR)区分死活细胞。A图完全没染任何色，阴性的大概是10的2次方，B C图中染死活染料以后，死活就不太容易区分阴阳性。即使仔细看强在B和C中分阴阳性，感觉阴性范围也不是像A图那个位置了。B只有死活染料，C还染色了CD3(APC), CD4(PE)和CD8(FITC).我在镜下用trypan blue染色确认了，感觉基本上都是活的细胞。

所以想请教一下是怎么回事儿？
谢谢。

niwanmao

wsjheaven 发表于 2020-11-25 13:10
倪老师，想请教一下，我用死活染料染色（thermo的live/dead NIR)区分死活细胞。A图完全没染任何色，阴性的 ...

这个结果还可以的。
只不过多色那管看你是不是邻近通道漏过来导致分得不够好？

wsjheaven

niwanmao 发表于 2020-11-25 14:06
这个结果还可以的。
只不过多色那管看你是不是邻近通道漏过来导致分得不够好？ ...

倪老师，我刚看了一下那个原理，这种死活染料基本上活细胞也会轻度染色，所以即使是活细胞也不可能跟阴性一样在10的2次方，会更亮一点。
我想问一下，那我这个怎么区分阴阳性呢？下面第一个图，也就5.png是我将图A作为fmo对照，用flow jo自动补偿以后的C图，这个结果是不是表明基本上是活细胞。
还有，您看我是不是可以把电压调低一点，让阴阳性分开？还是说跟抗体滴定一样，也滴定一下这个染料？


其次，就是调节补偿的时候，我就知道一个方法，就是用flow jo，但是我想问，就是在图3和4的情况下，这两种那中的阳性划分比较合适，就是这个CV比较大，所以想问阳性只选主体部分，像3一样；还是都选上，像图4一样。
或者您还有别的更好更准确的补偿方式推荐，或者相关操作方法的帖子。

谢谢倪老师了，回答了我很多问题，真的很感谢。

niwanmao

wsjheaven 发表于 2020-11-25 17:58
倪老师，我刚看了一下那个原理，这种死活染料基本上活细胞也会轻度染色，所以即使是活细胞也不可能跟阴性 ...

之前回答的时候，在手机上图片，没仔细观察，现在再看了下你前面的图，发现C图其实分群还是好的，按照如下画即可：


另外，关于补偿的调节，需要阳性群和阴性群充分分开，而不是像你这里那样粘在一起。

wsjheaven

niwanmao 发表于 2020-11-25 18:20
之前回答的时候，在手机上图片，没仔细观察，现在再看了下你前面的图，发现C图其实分群还是好的，按照如 ...

那如果2B这个图可以做fmo对照进行补偿吗？2C这个图染了三种颜色，其他的单染的图是刚附上的这些图，您看这种可以吗？