关于脾脏巨噬细胞染色及非特异性发光问题

半年y

倪老师您好，最近做脾脏巨噬细胞染色时出现了许多问题。第一个是关于F4/80染色问题，我采用的是FITC-F4/80（克隆株BM8）染色，为什么我的阴性对照在很多通道上都有发光？这是由于细胞自身被激发的非特异荧光吗？  我采用的这个FITC-F4/80的抗体染色是不是效果很不好？ 除此之外我的CD11b偶联的是APC-cy7荧光素，为什么CD11b的单标APC这么亮，怎么调补偿都调不下来，是否是因为APC-cy7使用不当或见光分解，导致APC也有发光？  还有就是老师我们最近做其他细胞亚群时，非特异性发光极强，总是出现各种拖尾大尾巴之类的，而同样的操作，我们几个月前的实验并没有出现如此多的非特异性发光，请问老师有没有什么解决办法？

阴性管

圈门步骤

niwanmao

F4/80分群确实差了些。
其它问题，我很难和你这些图联系起来，以后能够在图上直接标注，这样我们讨论的时候，更好找，你这里所说的CD11b单标图我根本找不到。但这里和CD206之间的这个分布，是可以的，这是多色流式常见的，强阳性Spreading error大造成的，可以用斜向十字门分析。

最后那几个图所说的非特异性荧光，这个可能与仪器液路有关，可先试着多次长清洗试试，或许或少一点，真不行，也可通过分析设门去掉。

半年y

niwanmao 发表于 2020-12-20 09:51
F4/80分群确实差了些。
其它问题，我很难和你这些图联系起来，以后能够在图上直接标注，这样我们讨论的时候 ...

谢谢老师的回答，老师我的第三张图就是CD11b的单标管，劳烦您在看一下吧

半年y

niwanmao 发表于 2020-12-20 09:51
F4/80分群确实差了些。
其它问题，我很难和你这些图联系起来，以后能够在图上直接标注，这样我们讨论的时候 ...

第三张CD11b的单标是我尽可能的调了补偿之后的图

liuruiluna

也可以看看抗体滴定下，抗体用量也会有这种红圈里的这种情况，，再就是显示的细胞数太多了，图里展示events减为5000或8000个可能图就好看多了，那些火箭峰可能比例也非常低

半年y

liuruiluna 发表于 2020-12-20 15:00
也可以看看抗体滴定下，抗体用量也会有这种红圈里的这种情况，，再就是显示的细胞数太多了，图里展示events ...

这个是最终收完显示的总细胞数，所以很多。抗体应该并不多，用的是原液十倍稀释后的稀释液。

niwanmao

半年y 发表于 2020-12-20 11:37
第三张CD11b的单标是我尽可能的调了补偿之后的图

我前面回答过了。

Kaminoko

同学你好，请问你第四张图里前侧向圈出的淋巴，有一小部分和主体是分开的，那一小群是怎么定义的，也是淋巴吗