流式检测CAR-T细胞中的CAR表达

风萧易水

有没有老师用流式做过CAR-T细胞中CAR表达检测的，很多文献都是用的protein-L的方法，但是我做过多次试验后发现，普通T细胞加了protein-L和PE后的背景信号也很强，有没有什么试剂可以封闭的？

niwanmao

是不是洗涤没洗好？我这边做出来分群很好的。

风萧易水

niwanmao 发表于 2021-4-30 10:21
是不是洗涤没洗好？我这边做出来分群很好的。

我每组用了2×10的5次方个细胞，去做的，PBS中含4%的BSA洗涤的，我看文献里面也是要洗很多次，结果T细胞的组信号就很强，CAR-T组的就没办法排除干扰了。

niwanmao

风萧易水 发表于 2021-4-30 10:55
我每组用了2×10的5次方个细胞，去做的，PBS中含4%的BSA洗涤的，我看文献里面也是要洗很多次，结果T细胞 ...

你把BSA去掉看看。纯PBS洗涤。

风萧易水

niwanmao 发表于 2021-4-30 10:58
你把BSA去掉看看。纯PBS洗涤。

好的，还有一个问题就是冲洗的时候一般是多少毫升的PBS，和洗涤的体积是不是有很大的关系？

niwanmao

风萧易水 发表于 2021-4-30 11:03
好的，还有一个问题就是冲洗的时候一般是多少毫升的PBS，和洗涤的体积是不是有很大的关系？ ...

一般常规用2ml。

风萧易水

niwanmao 发表于 2021-4-30 21:01
一般常规用2ml。

谢谢老师的回答，我又重新做了一次，这次专门比较了加BSA和不加BSA去洗涤，结果确实有区别，但是T细胞单独与PE孵育或者T细胞+protein L+PE后的信号已经很强了，还是没办法降低本底信号，不知道哪里出问题了。

niwanmao

风萧易水 发表于 2021-5-9 13:47
谢谢老师的回答，我又重新做了一次，这次专门比较了加BSA和不加BSA去洗涤，结果确实有区别，但是T细胞单 ...

可以明显看出，只加二抗的这管，也出现了明显的非特异性增高。所以我建议你对一抗和二抗，依次进行抗体滴定。
具体滴定步骤可搜站内资料。

风萧易水

niwanmao 发表于 2021-5-10 07:37
可以明显看出，只加二抗的这管，也出现了明显的非特异性增高。所以我建议你对一抗和二抗，依次进行抗体滴 ...

谢谢老师的解答。