为什么PBMC经CD3染色后再刺激 阴性对照能刺激起IFN-g表达

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请教各位老师，我用流式分选健康人的PBMC中 CD3+CD4+或CD3+CD8+细胞后，用病毒肽进行刺激后，染色上机（跟分选用相同的CD3/CD4/CD8抗体，再加IFN-g），发现不加肽的阴性对照组 其CD3+CD4+或CD3+CD8+细胞均表达较大量的IFN-g。
后面分别单独只用CD3、CD4、CD8一种流式抗体先将PBMC染色，以及分别单独用CD3、CD4、CD8一种磁珠分离PBMC，种到96孔板中，培养在含10% FBS的RPMI中，培养时加入IL2、BFA，16小时后（我们之前用前述病毒肽刺激 摸索的刺激时间）收集细胞染色上机（相同的CD3/CD4/CD8抗体，再加IFN-g），发现只要用CD3流式抗体染过色，或者经CD3磁珠分选出来的细胞，在没有肽刺激的情况下 就能检测到较高的IFN-g。（如下图，从前一个圈门CD3+CD4+或CD3+CD8+细胞出来）
请问：1、这跟抗体克隆号有关吗？前面分选和后面染色分析的CD3抗体是一样的，是BD的 FITC Mouse Anti-Human CD3，克隆号 HIT3a。
         2、我想分选（CD3+CD4）+（CD3+CD8+）以及CD3+CD4-CD8-的细胞，后面继续用肽刺激后分析，还能用什么策略？
        谢谢！

niwanmao

似乎这个染色阳性率都特别低嘛，不知道染色结果是否可靠？



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niwanmao 发表于 2021-8-24 15:52
似乎这个染色阳性率都特别低嘛，不知道染色结果是否可靠？

谢谢。
这个没有加肽刺激，都是染色或磁珠分选后，用培养基重悬后，加入IL2、BFA。
平常我们是做病毒肽刺激的，因为做过很多次 不会有问题 这次想节省细胞 就没有做了。
想说这个没有加入肽的情况下，经CD3染色或磁珠分选的 都刺激起来了，背景很高。

niwanmao

FUN 发表于 2021-8-24 15:58
谢谢。
这个没有加肽刺激，都是染色或磁珠分选后，用培养基重悬后，加入IL2、BFA。
平常我们是做病毒肽刺 ...

没刺激倒差不多的。
流式CD3+抗体，是有可能导致活化的，你可考虑改为阴选：CD11b, CD16, CD19, CD36, and CD56 去掉树突状细胞、单核细胞、粒细胞、B 细胞、血小板、早期红细胞前体细胞和 NK 细胞，留下的就基本上都是T细胞了，同时可避免CD3导致的活化。