急求，小鼠th17/treg流式可以一起做吗？

sci_bird

以前师兄师姐做th17/treg都是用一管同时把th17和treg检测了，不加刺激剂及阻断剂，具体步骤如图(分离淋巴细胞→37℃孵育4-6小时→染CD4抗体→固定、破膜→_→染IL-17A和Foxp3)。但是我看文献和试剂厂商的说明书，要分两管分别检测treg和th17。treg的话要同时染CD4、CD25，固定破膜后染foxp3，CD4+CD25+Foxp3+才定为treg。Th17的话要分离淋巴细胞后加诱导分化(佛波酯/离子霉素)和阻断细胞因子分泌的(布雷非德菌素 A/莫能霉素)，然后染CD4+ 后固定破膜完了染IL-17A。所以有点疑惑不清楚到底哪个方案合适，以前这个方案有没有问题？一管同时检测的弊端？检测treg时需不需要诱导分化？急求请前辈们予以指导，感谢

niwanmao

Treg可以无需刺激，但以IL-17检测Th17我记得不用PMA和离子霉素刺激应该是做不出来的。

sunny2829

同时检测和分开2管检测，这2个方案都可行的。
1管同时检测应该更有优势呀。
Treg是无需诱导分化的。而IL17A静息状态是不表达的，所以文献和实际说明书都会建议刺激活化和阻断。
参考以下BD流式8色实验方案——活化T细胞因子检测
流式8色实验方案-活化T细胞因子检测.pdf (1.02 MB, 下载次数: 90)

2022-6-17 13:57 上传

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scaleus

我觉得可以试试刺激+阻断后同时染TH17和TREG

sci_bird

niwanmao 发表于 2022-6-17 13:42
Treg可以无需刺激，但以IL-17检测Th17我记得不用PMA和离子霉素刺激应该是做不出来的。

...

好的，谢谢倪老师

sci_bird

scaleus 发表于 2022-6-17 16:19
我觉得可以试试刺激+阻断后同时染TH17和TREG

我打算这样试试

Climber

建议分成两次做，Treg不刺激，Th17刺激，P+I刺激可能会导致Treg的部分死亡，这一点我在小鼠肝脏组织来源的细胞会出现，脾脏来源的则不会，仅供参考。

lukequ

sunny2829 发表于 2022-6-17 13:58
同时检测和分开2管检测，这2个方案都可行的。
1管同时检测应该更有优势呀。
Treg是无需诱导分化的。而IL17A ...

你好，新手想问一下，染TH17需要固定破膜，那空白管、调电压的CD4单染管是否也需要固定破膜呢？

niwanmao

lukequ 发表于 2023-7-12 22:22
你好，新手想问一下，染TH17需要固定破膜，那空白管、调电压的CD4单染管是否也需要固定破膜呢？ ...

空白管目的是调节电压。
单染管是用于调节荧光渗漏的，一般需要单染强阳性的标记。
如果是新手，上述管子都做是可以的，可以不需要固定破膜，因为目的是确定电压范围和明确补偿值，与固定、破膜无关。

但如果要设置FMO管，则需进行相同的固定破膜步骤。