巨噬细胞加完抗体后消失了

薄乐

niwanmao 发表于 2022-6-27 16:40
空白管同样这两个图的图形是咋样的？

这样的，FSC宽了很多

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2022-6-27 17:52 上传

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hezeljgouc

薄乐 发表于 2022-6-27 17:53
这样的，FSC宽了很多

我个人感觉你的空白管中，FSC大的这群也不像是巨噬细胞，因为SSC太小了，建议仔细确认一下。
另外，你说的检测小鼠脾脏来源的巨噬细胞是直接制备脾脏单细胞检测，还是分离出巨噬细胞再检测？如果直接检测脾脏单细胞的话，因为巨噬细胞的数量只占脾脏免疫细胞大概1-2%，只记录15000个细胞太少了，目的巨噬细胞可能只有100来个。如果是分离出巨噬细胞再检测的话，可能是你的分离纯化过程出了问题。

薄乐

hezeljgouc 发表于 2022-6-27 18:33
我个人感觉你的空白管中，FSC大的这群也不像是巨噬细胞，因为SSC太小了，建议仔细确认一下。
另外，你说 ...

直接检测的单细胞悬液，因为老师说只要读1万个就可以，所以就照做了，我也很奇怪为什么这么点量就足够，按百分比算的话最后很可能会稀稀拉拉。

hezeljgouc

薄乐 发表于 2022-6-27 18:34
直接检测的单细胞悬液，因为老师说只要读1万个就可以，所以就照做了，我也很奇怪为什么这么点量就足够， ...

个人建议，你可以参考一下：
1. 记录细胞数量至少1*10⁵以上，最好3-5*10⁵
2. 巨噬细胞应该是FSC^hiSSC^hi，你圈的那一群可能不是巨噬细胞（SSC太小），建议对照文献仔细确认染色方案和圈门策略3. 不知道你一只小鼠能得到多少脾脏单细胞，一般来说应该有1-2×10⁸，如果制备得到的细胞总数太少，有可能你制备脾脏单细胞的方法或试剂什么的有问题，这可能导致巨噬细胞亚群丢失。而且你的样品中细胞碎片比例30-40%，确实有点高，建议再确认一下

niwanmao

薄乐 发表于 2022-6-27 17:53
这样的，FSC宽了很多

看到空白管，就清楚了，其实所有管子都没有明显的巨噬细胞，不存在巨噬细胞到了样本管就消失的问题。

薄乐

hezeljgouc 发表于 2022-6-27 19:07
个人建议，你可以参考一下：
1. 记录细胞数量至少1*10以上，最好3-5*10
2. 巨噬细胞应该是FSCSSC，你圈的 ...

感谢老师建议，我会在下次实验改进。

细胞总数确实是10^8数量级，但是测试管是分1*10^5个进行抗体孵育的，是否应该提升每个测试管的细胞数量？
碎片比例高的话有什么改进的建议么？目前使用的是注射器活塞和12孔板研磨，因为担心玻璃研磨器容易过研磨，然后使用裂红液去除红细胞。我有考虑过改用梯度分离，但是老师说效果差不多，不建议我改方法。

薄乐

niwanmao 发表于 2022-6-27 21:17
看到空白管，就清楚了，其实所有管子都没有明显的巨噬细胞，不存在巨噬细胞到了样本管就消失的问题。
...

感谢倪老师的回复，我会再仔细研究一下操作流程和结果。