火箭峰出现，见鬼了！！

culturelily

为何还是有火箭峰？
火箭峰部分是阳性细胞吗？

niwanmao

wmj123456 发表于 2025-1-12 11:09
倪老师，也就是说2群都是死细胞跟抗体产生的非特异性信号，通过无关通道看到这些信号都是在对角线。那为 ...

RF710呈现两群，只是意味着非特异性信号在阳性和阴性群都存在，至于判断是否特异，首先根据你这管单染管逻辑上就能判断，其次通过FITC和PE通道这些最适合观察常见非特异性信号的通道

wmj123456

niwanmao 发表于 2025-1-12 07:48
这两群都是，因为在RF710上面被分开了，而在FITC与其它通道的组合上，都很明显是非特异性信号

倪老师，也就是说2群都是死细胞跟抗体产生的非特异性信号，通过无关通道看到这些信号都是在对角线。那为什么在RF710上呈现左右2群的现象，这些非特异性信号分布无规律吧

niwanmao

wmj123456 发表于 2025-1-11 17:01
倪老师，关于非特异性信号想向您请教，样本为小鼠脾脏，这是单染RedFluor710做补偿的数据，跟其他通道两两 ...

这两群都是，因为在RF710上面被分开了，而在FITC与其它通道的组合上，都很明显是非特异性信号

wmj123456

niwanmao 发表于 2015-4-12 14:09
哦，昨天没注意到。
FITC/PE散点图出现火箭状的图形，多数还是跟状态不佳有关，可能live/dead染料能够排 ...

倪老师，关于非特异性信号想向您请教，样本为小鼠脾脏，这是单染RedFluor710做补偿的数据，跟其他通道两两参数调补偿时，对角线有一群非特异性信号为P1，还有一群非特异信号为P2。我觉得p1主要是死细胞产生的非特异性，但是p2的非特异性可能是怎么来的？

Arcrain

倪老师说的很对，波长长的通道自发荧光会降低（所以APC是个好通道！），但我观察到488，561光路的其它通道也都会有较明显的自发光形成的火箭峰，具体的可能要看实验样本了。

其实可以用短波长激发的激光（355nm，405nm）光路上的一些无关通道进行这种尝试。

niwanmao

Arcrain 发表于 2015-4-30 10:02
突然想到一办法。跟大家分享一下。
要想全部去除，可不可以在上面讨论的方法清除之后，在用两个完全无关的 ...

自发荧光和非特异性荧光多出现在FL1和FL2，而其它通道很少。可能用处不大。

Arcrain

突然想到一办法。跟大家分享一下。
要想全部去除，可不可以在上面讨论的方法清除之后，在用两个完全无关的通道做成二维图，看背景荧光，因为没有特异荧光溢漏，对角线分布的火箭峰就可以直接画门去掉，并且不会去掉有特异荧光的细胞。

我这样以前好像这么干过，不过没有用无关通道，而是直接在所测量的两个通道上把火箭峰画了个门。

Arcrain

我觉得，FSC-SSC分群不清楚的样本，还是要加live/dead染色。
我也发现live/dead染色的确不能将全部的火箭峰都去干净，这部分火箭峰颗粒用annexin-v和7-aad等死细胞染料都染不上，比例也是接近1%作用，在FSC-SSC和A-H分群都很清楚的时候画门也不能完全去除。

culturelily

續、寫。 发表于 2015-4-13 17:26
我的能够很好的分群，这样一般不会画到活性不好的细胞。

谢谢分享。这个是我做的脾细胞，请看看有什么问题。

culturelily

續、寫。 发表于 2015-4-12 13:42
我建议SSC电压调高一点，我感觉你的物理参数图分不开，脾脏细胞一般是3群，碎片+活性不好细胞+活性好的细胞 ...

您好，我表示做了几次预实验，脾细胞几乎没有分三群的，一般只分一群，是个倒过来的“逗号”的样子。能否把您的图发来看看。