寻求谜题破解，关于CCR7染色，世纪难题for me

Veblen

请问大家:
最常见的样本PBMC, PMA+BrefledinA刺激阻断后；
单染细胞能否看到CCR7的阳性，分群明显；
为什么刺激组全染，几乎看不到的CCR7的阳性，这是为什么？未刺激组的全染能看到CC7的阳性
(单染细胞和刺激组全染处理条件完全一样，因为涉及到细胞因子，所以表染后都固定破膜；同时CCR7是37度染色10min，CCR7-BUV496);
做了无数遍尝试，CCR7/CD445RA那张图就是不对，补偿也调节好了，就是全染中出问题；
这是怎么回事，请各位有经验的老师解答一下，感谢感谢。

niwanmao

一方面，刺激是否本身导致CCR7下调；另一方面，是否PMA导致CCR7内化。

因此，建议刺激后的样本，先做单纯的45RA和CCR7表面染色，确定刺激后的真实水平作为金标准。

然后再做全染，看全染步骤中的固定、破膜、究竟哪一步影响到CCR7结果。

ZRX

先做个不固定破膜的CD45RA和CCR7的染色看看呢。或者换抗体PE或者APC通道。我做T细胞激活记忆分型检测时候 CCR7-BV421分群也不明显，换成PE通道之后就可以了（这个抗体克隆号也换了，之前BV421的克隆没有PE的）

Veblen

ZRX 发表于 2025-11-27 14:25
先做个不固定破膜的CD45RA和CCR7的染色看看呢。或者换抗体PE或者APC通道。我做T细胞激活记忆分型检测时候 C ...

做过了不固定破膜的染色，没有问题，分群很明显。

Veblen

niwanmao 发表于 2025-11-27 10:00
一方面，刺激是否本身导致CCR7下调；另一方面，是否PMA导致CCR7内化。

因此，建议刺激后的样本，先做单纯 ...

刺激后的样本表面染色CD45RA和CCR7是没有问题的，分群很明显。
老师，您的意思是先表染后，固定破膜后，再与胞内抗体一起加进去，相当于染一次，是这样吗？

niwanmao

Veblen 发表于 2025-11-27 18:29
刺激后的样本表面染色CD45RA和CCR7是没有问题的，分群很明显。
老师，您的意思是先表染后，固定破膜后， ...

所有的表面标记都先染，不要进行固定破膜，这个时候先看一下样本结果，分群良好则继续固定，固定后再跑一次，看看是不是影响CCR7 了，如果是，则说明固定影响了。

如果固定没影响，再继续破膜、胞内染色，如果固定没影响，而破膜后影响，则是破膜剂影响。


这样才能找出影响的关键，对试剂进行调节。

ZRX

Veblen 发表于 2025-11-27 18:25
做过了不固定破膜的染色，没有问题，分群很明显。

那就在做一个CCR7在固定破膜之后染色和之前的对比

Veblen

niwanmao 发表于 2025-11-27 21:43
所有的表面标记都先染，不要进行固定破膜，这个时候先看一下样本结果，分群良好则继续固定，固定后再跑一 ...

好的，明白了，老师

Veblen

ZRX 发表于 2025-11-28 09:10
那就在做一个CCR7在固定破膜之后染色和之前的对比

好的，谢谢

zzzwd

这是一个正常的现象，拿我之前小鼠的脾脏细胞PMA刺激实验来举例，我当时鉴定的是T细胞里的mCD44和mCD62L，相比于未刺激组，刺激后mCD62L就“消失了”，这是由于PMA本身就是一种蛋白激酶C激动剂，与离子霉素（钙离子载体）联用，能绕过T细胞受体（TCR）直接强烈且同步地激活T细胞内的关键信号通路，而CD62L主要表达在Naive T或者Central memory T细胞，这一类细胞在刺激后会转变为Effecter T，而它的表型是CD44+mCD62L-。那最后你在PBMC刺激实验中观察到的CCR7下调现象，核心机制就是Naive T（和部分Central memory T）活化后，而进行的程序性表型转换。