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要做好面包，就有必要了解烘焙过程不同阶段发酵面团中的微生物状态，从而了解其对面包成品的贡献。
使用细胞平板计数菌落形成单位 (CFU) 的总活菌数是评估活微生物存在的传统标准。然而，CFU 方法只提供了有关能够长成菌落的细菌信息，但没有提供有关死菌、受损菌、有活力但不可培养 (VBNC) 细菌的信息（Oliver，2005；Salma ，2013）。VBNC定义是具有代谢活性但不能在液体或琼脂中生长和分裂的细菌（Kjelleberg，1993）。 VBNC 状态已在细菌 (Oliver, 2005) 和益生菌食品领域 (Davis, 2014) 进行了广泛研究。各种酵母物种（如酿酒酵母）能够通过添加亚硫酸盐可以被迫进入 VBNC 状态（Salma ，2013）。
流式细胞术分析 (FCA) 是一种快速、通用且可靠的工具，可用于确定代谢活性、膜电位或膜活性 (Porter et al., 1995)。对于微生物学家来说，它是 CFU法的补充方法（Robinson，2018）。 FCA已被用于检测发酵食品基质中包含的微生物的活力，例如啤酒（Bouix& Leveau，2000）、牛奶（Holm，2004）或果汁（Anvarian，2018）。然而，在固体基质上研究很少，没有人研究过酵母发酵的面团。通过实时可靠定量评估酵母活力的演变，可以为酵母在烘焙阶段的功能和重要性提供新的理解。
为了评估 FCA 方法，使用酿酒酵母菌株 SC1 或 SC2 制备面团，一式三份。简而言之，用 T55 小麦粉、水、盐和 0.7% w/w 速溶干酵母制备面包面团。发酵 70 分钟后，将大面团分成五块，放入五个相同的 ERO 中，烘烤 21 分钟。另外制备未发酵面团并用作阴性对照，以确定每种方法的背景信号。
在烘焙过程的不同时间点（0、10、12、14.5 和 21 分钟）在面团/面包的中心采集10g样品，重悬在37°C预热的100mL PBS中。
由于存在高背景信号，使用 FSC-H/SSC-H 标准设门无法准确获得总酵母细胞计数，所以采用细胞渗透性红色荧光核酸染料 **LDS751**（Laser Dyes Styril 751，λex = 543 nm/λem = 712 nm）标记细菌DNA，再结合DiBAC4染料 (DiBAC4, λex = 490 nm/λem = 516 nm) 区分死酵母和活酵母。染色方法是首先在 37°C 下样本与10ng/mL LDS751 一起孵育 10 分钟，然后再加入 1 μg/mL DiBAC4 5 分钟。最后上机100 μL/mL 的流速进行采集。
分析的时候，首先使用 BL-4（780/60 nm）选择 LDS75+ 酵母细胞，然后使用 BL-1（FITC对应的通道），采用使 BL-1-H/BL-4-H 散点图区分活酵母(DiBAC4-，绿色多边形门)和死酵母(DiBAC4+，蓝色多边形门) 细胞，从而确定酵母死亡率。每次采集4000 个事件。 小图（b）（c）（d）（e） (f) 分别是发酵前的面团、烘烤10、12、14.5、21分中的面团酵母死活情况。酵母细胞活力的百分比=[R1]x100/[R1 + R2]。小图g是没有加酵母的面团，用来指示背景信号，从而确定R1 和 R2 门位置。 小图h和i分别是发酵前和发酵第21分钟活酵母细胞（LDS751+ DiBAC4-）（绿点）和死酵母细胞（LDS751+ DiBAC4+）（蓝点）在FSC/SSC图上的分布位置。
这种检测的意义在哪里？文章似乎没有做出非常详细的阐述，而我也并非食品专业的，可能不一定说的对，但根据我的理解，用流式监测面团烘焙过程中的活酵母菌和死酵母菌数量，一方面有利于烘焙的标准化，另一方面有利于控制面包的口感和安全吧。你们觉得呢？
信源：Doppler F, Jelonkiewicz L, Rezaei MN, Lesens C, Toussaint R, Durand-Dubief M. Viability of Saccharomyces Cerevisiae during baking of bread dough by flow cytometry [published online ahead of print, 2022 Aug 6]. J Microbiol Methods. 2022;200:106556. doi:10.1016/j.mimet.2022.106556
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