国际细胞外囊泡协会 (ISEV) 将细胞外囊泡 (EV) 定义为“从细胞中自然释放的颗粒，由脂质双层包裹，不能复制，即不包含功能性细胞核”（Thery , 2018)。 EV 是一类异质性的颗粒，通过不同的生物发生途径产生，因此不仅表达显著不同的表面标记，而且还封装了不同浓度和不同种类的分子/遗传物质。EV的大小也是变异很大的，从直径约 30 nm 开始，在约 100 nm 处达到峰值，然后突然下降。人血浆中的EV浓度从10E4到10E12/mL之间，变化幅度高达8个数量级。
然而，目前缺乏用于校准流速、光散射和荧光的材料。校准材料用于将荧光信号从任意单位转换为 SI 单位。这种标准化非常重要，可使检测结果具有可比性，并能够量化不同流式仪器上典型样本中相同浓度的 EV。总体而言，所有这些因素（生物发生的异质性、大小、来源、生化成分、浓度、测量标准化）都会阻碍EV的检测。
现在有多种技术已被用于 EV 的大小、计数和表型分析，包括：

• 原子力显微镜 (AFM)
• 透射电子显微镜 (TEM)
• 低温 TEM
• 共聚焦显微镜
• 动态光散射(DLS)
• 纳米粒子追踪分析 (NTA)
• 电阻脉冲传感 (RPS)
• 拉曼光谱 (RS)
• 荧光显微镜
• 流式细胞术
  

尽管在 EV 的临床前研究中报告了一些技术的优势，但理想的技术应该提供无损分析、高分辨率、EV 摄取监测、简单性、时间效率、大小/浓度/电荷的同时量化、可重复性、成本有效性、低样本量要求、高通量且无需样本制备。

最常用的 EV 分析方法是流式细胞术 (FCM)。 FCM 能够同时对 EV 进行大小、计数和表型分析。尽管 FCM 是一种简单且在临床上常规使用的方法，具有高通量和同时检测各种表面抗原的潜力，但 FCM 对 EV 的准确分析仍有许多挑战，例如，EV 的大小分布是不均匀的，大多数直径小于 100 nm，这些小EV的表面积和抗原/蛋白质表达非常有限，因此，用荧光标记/抗体标记 EV 表面蛋白会产生微弱的荧光信号，传统 FCM 的灵敏度通常不足以检测和分析来自小EV的微弱荧光。 FCM 对 EV 荧光信号的敏感性进一步受到来自光学、电子、缓冲液等的较高背景噪声的影响。也就是说，FCM 的荧光灵敏度直接影响绝对 EV 计数。为了对所有大小的EV均能进行表型分析，FCM 的荧光灵敏度需要足够高以检测小EV 的微弱荧光信号，理想情况下可以检测到单个荧光分子。

除了通过荧光信号进行表型分析外，EV 的大小和计数也是基于 FCM 中的光散射和荧光进行的。然而，因为体积小和折射率值较低，EV散射的光强度非常弱。传统的 FCM 通常很难将这种弱信号与背景噪声区分开来。以前的实验发现只有 46% (n = 21/46) 的传统 FCM 能够检测600 nm 或更大的 EV 的光散射信号，并且在此阈值以下不敏感。约24% 的 FCM 无法检测到来自 400 nm 聚苯乙烯微球的散射信号。这些数据表明，传统的 FCM 可谨慎用于 EV 研究，因为只有一小部分 FCM 足够灵敏，可以检测100 nm 左右（即EV峰值大小）的颗粒。
尽管存在上述挑战等，FCM 仍然是研究 EV 的最可行技术。 因此有必要讨论一下流式在EV检测中的挑战和前景。

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