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多聚甲醛固定,究竟会对哪些免疫细胞计数产生影响?

发布者: niwanmao | 发布时间: 2022-10-26 21:58| 查看数: 266| 评论数: 0|帖子模式

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用多聚甲醛(PFA)固定,是做流式检测最广泛使用的方法。许多基于PFA的方法,使用的PFA浓度从1-4%不等(Lal等人,1988;Chow等人,2005;Pinto等人,2005;Diks等人,2019)。尽管PFA固定的既定做法在本领域很普遍,但关于PFA固定对流式结果的影响,特别是关于外周血白细胞的数据很少。

1981年Lanier和Warner用1%PFA固定的染色细胞(包括正常人PB淋巴细胞),发现可在4ºC避光环境中储存至少1周,光散射或荧光特性或细胞群的相对比例没有明显变化(Lanier和Warner, 1981)。

相反,在1988年,Lal等人报告说,使用Lanier和Warner的方案,固定过的正常人PB淋巴细胞,需要额外洗涤才能去除与固定有关的误差(Lal等人,1988)。而Lanier和Warner只使用了FITC结合的抗体,Lal等人评估了FITC和PE抗体结合的不同组合来检测B细胞、T细胞、中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。对于大多数测试的组合,细胞能保持其荧光特性至少2周。然而,对于另一些组合,会出现染色特异性的丧失(即阴性细胞也出现阳性)或荧光强度的降低(即阳性荧光信号的丢失)。目前认为这些变化是由细胞膜的完整性和抗体的不稳定性、与荧光素的连接和/或与目标抗原的结合造成的,但不是由细胞释放的蛋白酶造成的。

2007年,Stewart等人使用FITC标记的抗体检测PB中的淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞,在用1%PFA固定后立即进行纵向流式细胞仪分析,并在4天后逐渐增加。与Lanier和Warner以及Lal等人不同的是,Stewart等人观察到光散射和荧光特性随着时间的推移发生了明显的变化,而额外的洗涤不能避免这种变化(包括前向和侧向散射的逐渐减少,自发荧光的逐渐增加)(Stewart等人,2007)。

Vistica Sampino E等人分析了13个人免疫细胞群,结果发现,使用2%PFA的标准固定方案,会影响CD8、CD4和Treg、单核细胞和嗜碱性细胞的结果,因此必须谨慎。

下面直接看图,各个群体的未固定和固定后的结果对比。

CD8+T,对CD8+ TN和CD8+ EM有显示影响:
截屏2022-10-26 21.43.09.png 截屏2022-10-26 21.43.28.png


CD4+T,对CD4 TN、CD4 TE、CD4 TEM、CD4 TCM、TReg均影响明显:
截屏2022-10-26 21.45.42.png 截屏2022-10-26 21.45.52.png


B细胞,Naive B影响明显:
截屏2022-10-26 21.46.10.png


浆母细胞,无显著影响(流式中文网注:下图中的浆母细胞Plasmablast设门是错误的,应为CD38高表达CD24-那群,该文的Reviewer评审不细心,请大家注意)
截屏2022-10-26 21.46.27.png


单核细胞,经典型和非经典型均有显著影响:
截屏2022-10-26 21.46.42.png


DC及其亚群,无显著影响:
截屏2022-10-26 21.48.18.png


NK细胞及其亚群,无显著影响:
截屏2022-10-26 21.48.43.png


干细胞,无显著影响:
截屏2022-10-26 21.48.55.png



中性粒细胞,无显著影响:
截屏2022-10-26 21.50.52.png


嗜酸粒细胞,无显著影响:
截屏2022-10-26 21.51.03.png


嗜碱粒细胞,有显著影响:
截屏2022-10-26 21.51.13.png




信源:Vistica Sampino E, Morgan J, Chorzalska A, et al. Comparative flow cytometry-based immunophenotyping analysis of peripheral blood leukocytes before and after fixation with paraformaldehyde [published online ahead of print, 2022 Oct 21]. J Immunol Methods. 2022;113379. doi:10.1016/j.jim.2022.113379

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