流式中文网 门户 查看主题

如何用流式检测胞葬作用(Efferocytosis)?

发布者: niwanmao | 发布时间: 2023-1-5 14:06| 查看数: 157| 评论数: 0|帖子模式

亲爱的FLOWER,加入流式中文网,一起讨论,一起学习,享受更多福利吧!

您需要 登录 才可以下载或查看,没有账号?加入流式中文网

x
胞葬作用(Efferocytosis)是指吞噬细胞从组织中清除凋亡细胞和凋亡小体的过程,由凋亡细胞释放的炎症介质启动,在解决炎症方面起着关键作用(Doran等人,2020)。

如果没有Efferocytosis,凋亡细胞和凋亡小体可以诱发二次坏死(Doran等人,2020年)。有证据表明,巨噬细胞对凋亡中性粒细胞(PMN)的吞噬功能受损,导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的持续肺部炎症,这是急性肺损伤(ALI)的一种严重形式(Gr´egoire等人,2018)。
Radbel J等人建立了一个ALI模型,通过让小鼠接触臭氧,然后静脉注射脂多糖(LPS)来诱导ALI。由臭氧和LPS诱导的ALI与持续的中性粒细胞增多和常驻肺泡巨噬细胞(AM)的激活有关,是一种有用的ALI的实验模型,可评估常驻AM对肺部PMN的吞噬作用。为此,他们开发了一种比较方便的评估Efferocytosis的流式方法。

整体流程
20230105_111613.jpg

详细步骤
特定的无病原体C57BL6/J雄性小鼠(12-13周)。

小鼠被安置在过滤器顶部的微型隔离笼中,并保持食物和水的自由供应。臭氧是通过紫外光发生器从氧气中产生的,并与空气混合,如前所述(Francis等人,2020年)。使用光度臭氧分析仪(2B Technologies, Boulder, CO)连续监测室内的臭氧浓度。通过调整紫外光的强度和进入室内的臭氧流速来维持臭氧浓度。小鼠被暴露在臭氧(0.8ppm)或过滤空气中3小时。

用3mg/kg LPS(大肠杆菌O128:B12,Sigma-Aldrich,St. Louis, MO)来诱导内毒素血症,或者用磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为空白对照。(注:虽然单独的臭氧和LPS可以诱导体内的PMN反应(Hollingsworth等人,2007年;Matute-Bello等人,2008年),但使用联合暴露可以最大化这种反应,以便确认流式方法的性能。)

在暴露于臭氧+LPS(实验组)或过滤空气+PBS(对照组)的24小时后,对小鼠进行安乐死。用5毫升冰冷的无菌PBS经右心室原位灌注肺部。通过插入气管向肺部缓慢灌注和抽取1毫升冰冷的无菌PBS(pH值为7.4)同时轻轻按摩组织,收集肺泡灌洗液。

灌洗液离心(300 x g,8分钟,4◦C)后重悬于缓冲液(含有2% v/v 胎牛血清(FBS)和1 μM EDTA的PBS)中。

用1毫升Hybri-Max™裂解缓冲液(Sigma-Aldrich)在室温下裂解小鼠肺泡灌洗液中的红细胞5分钟。

使用MidiMACS®(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)磁分离收集臭氧+LPS暴露小鼠的Ly6G+ PMNs。剩余的Ly6G-细胞,通过EasySep™小鼠CD11b阳性选择试剂盒(Stemcell technologies, Vanouver, Canada),分出CD11b- 肺泡巨噬细胞(AM)。

使用台盼蓝染料拒染法计数活细胞和纯度。Ly6G+细胞为92.7±4.0%的PMNs;CD11b-细胞为95.3±2.0%的AM(平均值±SE,n=3次实验)。

分离好立即用Annexin V/ PI染色确认中性粒细胞的凋亡情况:
20230105_113225.jpg

用2μM PKH26或5μM D12730(Molecular Probes, Eugene, OR)标记PMNs(二选一即可)。

后面,是评估Efferocytosis的重要步骤,在无菌无涂层的Nunc™24孔培养板中,在37◦C下将常驻AMs(CD11b-)与标记的PMNs共同培养90分钟,PMN:AM的比例为5:1、3:1和1:1,培养条件为含10% v/v FBS和1% v/v青霉素/链霉素的DMEM/Nutrient Mixture F-12(无酚红)。

共培养完成后,用1ml预冷生理盐水清洗培养板5次,收集细胞。用PBS清洗细胞,离心(300×g,8分钟,4◦C),然后用PBS再洗涤一次,以去除非吞噬物质;然后上机获取或用3%多聚甲醛固定过夜后用荧光显微镜观察。如果PMN染的是PKH26,则用488激发,576±21nm收集PKH26荧光信号;如果PMN染的是D12730,则用640激发,671±30nm收集D12730荧光信号。。作者比较了PMNs和AMs的5:1、3:1和1:1的比例,发现,在5:1的比例下观察到最大的Efferocytosis反应。 由于作者在文章中没有用流式来评估Efferocytosis结果,而是用荧光显微镜,给出直接的图像,但实际上流式也可直接测,具体步骤就是后面要讲的区分发挥Efferocytosis作用的AM亚群:
20230105_135407.jpg

为了进一步确定发挥Efferocytosis的AM亚群特征,将CD11b-AMs和PMNs在37◦C和4◦C(4℃是Efferocytosis的阴性对照)共同培养90分钟,然后收集细胞,以100μl的染色缓冲液(PBS,2%FBS和0.02%的叠氮钠)重悬,用抗小鼠CD16/32(1:100;克隆93;Biolegend)阻断非特异性结合,然后加入FITC CD11b(1:100;克隆M1/70;Biolegend)、PE-Siglec F(1:10;克隆ES2210D8;Miltenyi)、PE-Viol770-CD45(1:50;克隆30F11;Miltenyi),Brilliant Violet 421-CD11c(1:100;克隆N418;Biolegend)和ViolGreen Gr-1(Ly6G,1:50;克隆REA810;Miltenyi)抗体孵育15分钟,接着用染色缓冲液洗涤细胞,上机获取,可见Resident AM明显是Efferocytosis的主力:
20230105_134958.jpg

Radbel J, Meshanni JA, Gardner CR, Le-Hoang T, Cervelli J, Laskin JD, Gow AJ, Laskin DL. Novel method to assess resident alveolar macrophage efferocytosis of apoptotic neutrophils by flow cytometry. Toxicol Appl Pharmacol. 2022 Dec 21:116359. doi: 10.1016/j.taap.2022.116359. Epub ahead of print. PMID: 36565939.

最新评论

关闭

本站推荐上一条 /1 下一条

手机版|流式中文网 ( 浙ICP备17054466号-2 )

浙公网安备 33038202004217号

GMT+8, 2023-1-31 14:23

Powered by Discuz! X3.4

© 2001-2013 Comsenz Inc.