找回密码
 加入流式中文网

QQ登录

只需一步,快速开始

流式中文网 门户 查看主题

冻存的PBMC能用于流式检测吗?什么冻存和复苏条件最好?

发布者: niwanmao | 发布时间: 2023-5-2 14:04| 查看数: 543| 评论数: 0|帖子模式

亲爱的FLOWER,加入流式中文网,一起讨论,一起学习,享受更多福利吧!

您需要 登录 才可以下载或查看,没有账号?加入流式中文网

×

PBMC提取出来之后,可冻存起来,后续集中进行流式检测,但是主要是限于适应性免疫更多见,在Cytometry杂志的OMIP系列中,经常可看到。
那么,如何冻存,如何复苏呢?这可能会影响到PBMC的活力。
冻存
首先,用Ficoll或Percoll提取PBMC,然后,使用无菌玻璃吸管转移到装有tris-buffered (pH 7.5) saline solution(BSS)的15mL管中,然后在20˚C下再次以500g离心PBMC 10分钟,去上清。随后,将PBMC重悬于AB型血供者的4 mL 热灭活人血清(heat-inactivated human serum pool,HSP),在4˚C下储存10分钟。
接着,制备冻存培养基,每4ml包括3.2 mL不含L-谷氨酰胺的RPMI 1640和0.8 mL二甲基亚砜。将4˚C冻存培养基滴加到前述重悬在HSP的PBMC中,二甲基亚砜的最终浓度为10%。
然后,将冻存管直接放置在-80˚C冰箱的架子上,可保存2周。如果需更长保存时间,则需进行程序化降温,逐步保存到液氮。

复苏
丹麦的Hønge BL等人通过测量细胞活力和绝对活PBMC计数,系统地评估了PBMC解冻过程中的七个步骤,见下图,各个步骤中均对比了不同方式:
20230502_105843.png

结果发现,活PBMC数量在很大程度上取决于洗涤液的成份和温度、离心力、离心持续时间和孵育持续时间,相反,并没有发现改变解冻时间、PBMC和洗涤液的混合方法、离心温度等条件的影响。
其中,效果最好的洗涤液成份是含20%胎牛血清的RPMI 1640,37°C洗涤。当在 15 mL Falcon 管中使用 10 mL 洗涤液时,样本应以 500 g 离心至少 10 分钟。PBMC 可在 37°C 5% CO2 培养箱中孵育(静置)长达8小时而不影响活细胞数量,但孵育 16 小时会显著降低存活率和回收率。

信源:Hønge BL, Petersen MS, Olesen R, Møller BK, Erikstrup C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLoS One. 2017 Nov 1;12(11):e0187440. doi: 10.1371/journal.pone.0187440. PMID: 29091947; PMCID: PMC5665600.

最新评论

手机版|流式中文网 ( 浙ICP备17054466号-2|浙ICP备17054466号-2 )

浙公网安备 33038202004217号

GMT+8, 2024-4-23 02:38

Powered by Discuz! X3.5

© 2001-2024 Discuz! Team.

快速回复 返回顶部 返回列表