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一个简单的技巧,实现大分子抗体药物的内化(胞吞)检测

发布者: niwanmao | 发布时间: 2023-5-25 14:29| 查看数: 352| 评论数: 0|帖子模式

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前几天赤道和北极站友发帖问道:大分子抗体药物,例如靶向细胞表面CD3分子,如何检测T细胞有没有胞吞该药物呢?有没有老师用流式做过类似实验或者设计呢,谢谢

虽未做过这方面资料,但是我还是认真去搜了文献,发现在2015年有篇文献恰好谈到了这个步骤,在此将此步骤编译分享给有相同需求的站友:

首先,需要将抗体药物标记上荧光素。此文献以APC标记其抗体药物CD3。

接着,靶细胞用500μl 预冷的RPMI(含2%BSA,10 mM HEPES, pH 7.4)重悬,加入100μl 荧光素标记的抗体药物,文献中是CD3 APC抗体(10μl抗体/10E6个细胞),抗体用量的宗旨就是过量,使结合呈饱和状态。

然后在4℃下孵育1小时,用5ml 预冷的RPMI(含2%BSA,10 mM HEPES, pH 7.4)洗涤两次以去除过量的抗体,重悬在1ml RPMI(含2%BSA,10 mM HEPES, pH 7.4)中,并在37℃下再次孵育以使得抗体药物内化

内化完成后,将细胞分成两份:
一份加入2ml 预冷PBS(体现已结合的总抗体量,包括表面的和内化的)
另一份加入2ml 预冷的PBS(pH 2.0,酸洗作用,可去除表面结合的抗体,以检测内化/胞吞的抗体药物量),细胞酸洗45秒,然后用10ml 预冷PBS(含0.05%叠氮钠)中和。

最后,将两管样本离心,放入500μl 预冷PBS(含2.5μg/ml碘化丙锭)中。上机分析。

检测结果如下:
20230525_142600.png

信源:Beltran-Sastre, V., Navarro, E. Measuring activity of endocytosis-regulating factors in T-lymphocytes by flow cytometry. Cytotechnology 67, 551–558 (2015). https://doi.org/10.1007/s10616-014-9696-1

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