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使用GFP融合结合流式细胞术监测、优化大肠杆菌中重组人TNFα的产量

发布者: niwanmao | 发布时间: 2023-8-23 10:10| 查看数: 279| 评论数: 0|帖子模式

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英国的Zulkifly NAH等人在2023年8月2日的Front Bioeng Biotechnol.上,介绍了一种生物制药优化新方法,就是:
使用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因,通过流式细胞术监测培养物异质性和产量,从而优化大肠杆菌中重组人肿瘤坏死因子α(TNFα)的产量。

GFP融合能实时监测重组蛋白的产量
作者构建了含有TNFα与GFP融合的质粒构建物,这些构建物由T7或araBAD启动子系统调控。通过比较仅表达GFP和表达TNFα-GFP融合蛋白的菌株的荧光强度,可以监测TNFα表达水平。流式细胞术的快速单细胞分析,可作为重组蛋白产量和折叠状态的指标。
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压力最小化和生理优化提高TNFα-GFP的产量
在摇瓶和生物反应器中尝试了各种培养条件,以优化TNFα-GFP的产量并减少生理压力。较低的生长温度(30°C)、使用甘油而非葡萄糖以及降低诱导剂浓度有助于促进蛋白的正确折叠和溶解度。将这些压力最小化策略与严格调控的araBAD启动子在30°C的甘油培养基中相结合,可在摇瓶中获得最高质量的TNFα-GFP产量。

Fed-Batch生物反应器进一步提高产量
通过将经过优化的摇瓶培养迁移到装备了喂料机制的生物反应器中,实现了更高的细胞密度和TNFα-GFP产量。与摇瓶相比,生物反应器培养物的荧光更均匀,非产物细胞更少。最终的荧光测量结果在生物反应器和摇瓶之间相似,但更高的细胞密度增加了每单位培养体积的总产量。

流式细胞术为快速筛选提供了快速过程分析技术
本研究中采用GFP融合方法的一个重要优势是能够使用流式细胞术快速分析表达菌株与培养条件之间的相关性。GFP荧光可代表可溶性TNFα产量,比传统的SDS-PAGE等定量方法能更快地检测结果,从而优化条件。
该研究典型地展示了一种合理的优化策略,将生理压力减少和细胞学分析过程相结合,改善大肠杆菌中具有挑战性的生物制药生产。这些方法和发现为快速开发其他重组蛋白制造过程提供了一个模板。通过展示GFP融合和实时流式细胞术数据的优势,该研究促进了它们在加速过程筛选和优化中的广泛应用。

参考文献:Zulkifly NAH, Selas Castiñeiras T, Overton TW. Optimisation of recombinant TNFα production in Escherichia coli using GFP fusions and flow cytometry. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1171823. Published 2023 Aug 2. doi:10.3389/fbioe.2023.1171823

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