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无需富集,也能用流式直接从血浆中分选出细胞外囊泡

发布者: niwanmao | 发布时间: 2023-8-30 09:54| 查看数: 351| 评论数: 0|帖子模式

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细胞外囊泡(EVs)是由各种细胞类型释放的纳米大小(约30-1000纳米)的脂质包裹颗粒。EVs存在于生物体液中,被认为是疾病检测和监测的有潜力的材料。由于太小,EVs的分离和研究都具有一定的难度。在复杂的生物样品中,其他小颗粒和污染蛋白使得基于EVs的生物标志物的发现和验证变得更加困难。

加拿大的Khanna K等人评估了流式细胞术在纳米尺度范围内分离EV的能力,认为:利用流式细胞术,我们可以从预富集的EV产物中分选,也可以无需任何EV预富集就能直接从血浆中分选出CD9阳性EVs,这些结果证明流式细胞术可以作为分离EVs的一种方法。

方法探索

他们首先测试了流式细胞仪检测和分辨不同尺寸(0.1微米到0.9微米)的荧光聚苯乙烯纳米颗粒的能力,确认了该仪器能够区分这个尺寸范围内的颗粒。

接着,使用GFP标记的小鼠白血病病毒(直径124纳米)作为生物纳米颗粒标准,既分析了缓冲液中的病毒,也将其加入到血浆中以观察是否可以检测到病毒。病毒在背景噪声之上以荧光形式被可靠地检测到。然后对其进行设门和分选,以证明分离生物纳米颗粒的可行性。

为了测试EV分离效果,使用荧光抗CD9抗体对血浆样品中的EV进行免疫标记。检测到并分选了CD9阳性的EV。

对分选的CD9阳性EV进行了专用纳米流式细胞技术特性分析,以验证其分离性。去污剂TritonX-100裂解效果,证实了分离出的EV的脂双层性质。
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多参数分选则是通过同时标记CD9和CD41并分选出双阳性事件。
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使用纳米颗粒跟踪分析分析了分选EV的尺寸分布,显示了一个大约为100纳米的主峰大小。
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总的来说,他们的逐步方法通过优化流式细胞术参数和使用荧光标记,展示了检测、设门和分离100纳米颗粒的能力。通过从类似血浆的复杂生物液体中分离出定义的EV亚群,展示了其实用性。

使用流式细胞术从血浆中分离CD9阳性细胞外囊泡(EVs)的关键步骤

样品制备:

  • 收集血浆样本,并通过0.8微米过滤器过滤以去除较大的颗粒。

免疫标记:

  • 取100微升过滤的血浆。
  • 在室温下与荧光标记的抗CD9抗体(如15 ng/mL的CD9-CF405M)一起孵育30分钟。
  • 添加PBS使总体积达到300微升。

流式细胞术设置:

  • 使用针对小颗粒检测进行优化的流式细胞仪(如Astrios EQ)。
  • 以前向散射信号为触发器。设置阈值以分出超过背景的EVs。
  • 应用荧光标记(CD9-CF405M)来检测EVs。

筛选CD9阳性EVs:

  • 使用FMO和同型对照来设置分选边界。
  • 识别CD9阳性群体并设置分选门。

分选:

  • 将CD9阳性事件分选到含有PBS的试管中。收集阴性群体作为对照。
  • 分选时间可能范围从3到8小时,取决于样本。

分选后处理:

  • 使用100kD旋转滤器,在2000xg进行离心浓缩EVs。
  • 添加BSA以减少EV的损失。
  • 使用多种验证手段(如FC、WB、EM、NTA)以确认分离的CD9+ EVs。


参考文献:Khanna K, Salmond N, Halvaei S, Johnson A, Williams KC. Separation and isolation of CD9-positive extracellular vesicles from plasma using flow cytometry. Nanoscale Adv. 2023;5(17):4435–4446.


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