流式不同温度染色的顺序

kloading

如题，我有三批抗体需要染：

1. 常规表面抗体，4℃ 30min；

2. 趋化因子受体，37℃ 1h；

3. 胞内因子，室温 40min。

第三部分的胞内因子肯定是要安排在最后的，主要纠结的点在于1和2。假如先染表面抗体的话后续37℃染色会不会让他们丢失？而先染趋化因子受体的话，由于趋化因子受体大都是大蛋白，会不会影响如CD45,CD3等常规抗原表位的结合？


求解！

niwanmao

kloading 发表于 2024-1-28 10:22
CXCR5,CXCR6，请问老师室温染色多久呢

这两个我没试过。
我们前面那三个，就跟其它表面标记一样的染色方法，室温15分钟

niwanmao

你要染的是什么趋化因子受体？我们平时CCR6、CXCR3、CCR4等都是室温染色的

kloading

CXCR5,CXCR6，请问老师室温染色多久呢

kloading

收到 谢谢老师

19874649902

老师，请问外周血分离体外培养的细胞也表染和胞内抗体都室温染色15min，会不会导致死细胞过多呢？

niwanmao

19874649902 发表于 2024-2-21 11:51
老师，请问外周血分离体外培养的细胞也表染和胞内抗体都室温染色15min，会不会导致死细胞过多呢？ ...

表面染色15分钟。胞内染色不止，先固定，后破膜，整个下来可能得1小时。
染色操作手法轻柔，不会导致细胞死亡过多。

19874649902

niwanmao 发表于 2024-2-21 14:48
表面染色15分钟。胞内染色不止，先固定，后破膜，整个下来可能得1小时。
染色操作手法轻柔，不会导致细胞 ...

谢谢老师！我是先表染室温固定15min，破膜离心500g 8min两次，然后加胞内抗体室温染15min，加破膜剂500g 8min离心后加PBS上机。中间每次加抗体或离心后，都是用一档涡旋混匀的，会是震荡太大力了吗？

niwanmao

19874649902 发表于 2024-2-21 17:36
谢谢老师！我是先表染室温固定15min，破膜离心500g 8min两次，然后加胞内抗体室温染15min，加破膜剂500g  ...

我不知道你用的是什么破膜剂，如果最后的结果是细胞都没了，需要从多方面去排查：
1、细胞本身是否状态不好？
2、这里破膜剂加了之后离心这么多次，是有问题的
3、加破膜剂之前，细胞上机获取一下，看状态如何？
3、加破膜剂后，30分钟，再上机获取一下

找出究竟哪一步导致的，集中进行改善

19874649902

niwanmao 发表于 2024-2-21 19:36
我不知道你用的是什么破膜剂，如果最后的结果是细胞都没了，需要从多方面去排查：
1、细胞本身是否状态不 ...

好的，谢谢老师！