细胞凋亡十字门应该怎么定位？

zuohaoliushi

我的所有实验用的都是同一种细胞，只不过每次处理不一样，有的是加小干扰敲低基因后测凋亡率的改变，有的是加药之后测凋亡率的改变，每种处理都会设置对照组和实验组。
凋亡试剂盒是Annexin V和PI双染。
仪器是贝克曼的。
通道选的是Annexin-FITC，PI-PC5.5。

想教一下大家：
①可以用未经任何处理的亲本细胞，设置空白组、单染Annexin V组，单染PI组，双染组，这样建个模板，之后的所有样本都用这一个模板检测吗？
②我对十字门的定位还不是特别理解，目前是这样设置的，看单染Annexin V的Annexin V-count直方图，确定阳性群起始处对应的电压值，再看单染PI的PI-count直方图，确定阳性群起始处对应的电压值，以这两个值设置十字门。但是有些疑惑的是：首先不知道我这样对不对？其次我发现这样画出的门其实并不适用于我后续的样本（会压到细胞群），看了一些帖子说实验组和对照组的十字门得是一样的，我想问一下，在保证各种处理的实验组和对照组的十字门一样的前提下，不同处理——未经任何处理的亲本细胞、加小干扰及其对照组，加药及其对照组，这三种处理之间的十字门可以不一样吗？

wxd

第一个问题，不建议用未经处理的亲本细胞设置空白组、单染Annxin V组和单染PI组以及双染组建立模版的。因为药物处理可能会导致细胞发生一些荧光染色的改变，未经处理的亲本细胞不能显示这些变化，在后续的检测中可能会遇到问题。
第二个问题，你对十字门的定位理解是对的。之所以画出来的门不适合后续样本，可能是你只选择了未经处理的亲本细胞来设门，建议你染色前，从每个处理组中分别吸一部分细胞混合在一起，再均分为3份，分别作为Blank、Annexin V和PI单染。这样做的单染因为有所有处理组的细胞，所以可以代表这个实验整体的细胞分布，根据这个设门，理论上是不会压到细胞群的。
最后，你说的“在保证各种处理的实验组和对照组的十字门一样的前提下，不同处理——未经任何处理的亲本细胞、加小干扰及其对照组，加药及其对照组，这三种处理之间的十字门”在这三种处理分别有各自的Annexin V和PI单染作为对照证明这种设门方式是合理的，这种情况下是可以不一样的。

zuohaoliushi

wxd 发表于 2024-1-29 15:16
第一个问题，不建议用未经处理的亲本细胞设置空白组、单染Annxin V组和单染PI组以及双染组建立模版的。因为 ...

太感谢你了！！