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使用基于流式细胞术的FRET技术(FACS-FRET)分析分子间相互作用

发布者: facetodog | 发布时间: 2024-7-10 13:39| 查看数: 75| 评论数: 0|帖子模式

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本帖最后由 facetodog 于 2024-7-10 16:08 编辑

  最近在一篇文献中看到使用FACS-FRET的方法,这个方法虽然发展了接近二十年且相较于激光共聚焦显微镜的测量具有较大优势,但其复杂性和缺乏标准化方法制约了该技术在流式领域的更多应用,近些年来才在部分研究中有了进一步应用,结合一篇综述,简单归纳如下。

FRET和基于流式细胞术的FRET(FACS-FRET)
  Förster resonance energy transfer (FRET) 是一种广泛使用的技术,是一种用于检测活细胞中蛋白-蛋白相互作用的有力工具。该技术基于两个荧光分子之间的能量转移,其中一个作为供体,另一个作为受体。当两者在纳米级距离内接近时,供体激发能量非辐射地转移到受体,导致受体荧光增强而供体荧光减弱。这种能量转移依赖于供体和受体之间的距离及相对取向,通常发生在1-10nm范围内。FRET通常是通过共聚焦显微镜测量的,但基于流式细胞术的FRET(FACS-FRET)在过去十年中越来越流行,并且使用得更普遍。基于流式细胞术的FRET(FACS-FRET)提供了在短时间内评估大量细胞中FRET的可能性,从而可以对多个样品中的FRET进行严格并且在统计上可靠的定量分析。
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  Lim等人在综述中讨论了FRET技术的基础、最新发展和未来展望。他们强调了选择合适的FRET反应对的重要性,以及如何优化实验条件以提高FRET效率。

  供体和受体FRET配对选择过程中的注意事项:
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  目前,有多种方法可以测量单荧光基团 FRET和多种荧光基团 FRET(Hetero-FRET),如下图:
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  不同的技术中,仅测量受体分子的激发发射。这是测量FRET的最简单方法,也是在基于流式细胞术的FRET中利用的主要技术。因此,必须准备不同的样品作为预期测量的对照:
(i) Donor fluorophore only.仅供体荧光基团。
(ii) Acceptor fluorophore only.仅受体荧光基团。
(iii) Donor and acceptor fluorophore fused together.供体和受体融合荧光基团。
(iv) Donor and acceptor fluorophore separately.供体和受体独立荧光基团。

  虽然这种方法相对简单,但当通过荧光显微镜完成时,主要缺点是各种成像通道之间存在巨大的荧光串扰,这导致了高背景和低信噪比。为了解决这个问题,扩展图像处理和归一化是必要的。儿基于流式细胞术的FRET技术(FACS-FRET)测量中使用的主要是激发发射,供体的淬灭作为通过FACS评估FRET的稳健技术相对较早。另一种方法是基于FLIM的FACS-FRET,它仅限于特殊的流式细胞仪。

  该综述讨论了FRET技术在不同生物学应用中的潜力,包括研究酶活性、细胞凋亡、膜接近性以及细胞内信号传导等。

FACS-FRET的应用方向:
  从本质上讲,FACS-FRET能够测量几乎所有细胞中的FRET。到目前为止,它不仅被用于研究细胞质中的蛋白质相互作用,例如用于检测细胞通路或蛋白质自组装,还用于质膜或不同的膜,如内质网,并用于分析受体寡聚化。
  当测量同一膜亚结构域中荧光基团之间的FRET时,Winkler等的研究表明,由于分子自由扩散的空间要小得多,因此没有直接分子相互作用的随机FRET更频繁地发生。为了确定FRET阳性细胞,必须考虑到这一点,尽管效果相对较弱。
  FACS-FRET也可用于研究细胞内病毒蛋白的寡聚化,在这种情况下是乙型肝炎病毒的S蛋白,及其在亚病毒单位形成中的作用。该技术还被用于研究病毒和宿主蛋白质之间的相互作用。
  FACS-FRET不仅限于哺乳动物细胞,还可用于研究其他生物体,如布氏锥虫等原生动物。
  FACS-FRET的另一种方法是研究单个氨基酸位置对蛋白质相互作用和功能的影响。该技术还可以研究药物治疗对分子相互作用的影响,
  FRET的许多其他应用在显微镜上已经实现,例如酶活性、caspase cleavge导致的细胞凋亡、膜探针的接近程度或细胞内信号传导,即cGMP或钙信号传导等,这些测量通常由特定的FRET报告基因实现,读数是通过显微镜观察来实现的,未来基于报告基因的FRET也会适用于FACS-FRET。
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FACS-FRET的局限性:

  尽管FACS-FRET具有巨大的潜力,使其成为当代生物医学研究的有力工具,但它并非没有局限性。其中大多数源于FRET本身的自然限制,例如细胞被转染以过表达FP-tagging的靶蛋白,这可能导致亚细胞定位和功能改变、ERAD(内质网相关降解)激活和细胞毒性等伪影。因此,与基于抗体的FRET相比,一个主要的制约因素是需要靶蛋白的外源性表达,而通过CRISPR/Cas9对内源性宿主细胞蛋白进行FP-tagging可以克服这一障碍。
此外,FRET的缺失并不一定意味着缺乏相互作用。这是由于FRET的固有特性,为了实现有效的能量转移,两个荧光团之间的距离非常小是必要的。该距离可能远高于10nm,例如,由于使用了发色团标记的抗体及其固有的大小,或者由于细胞器和膜等距离增加参数导致FRET信号欠佳。另一方面,即使是积极的FRET信号也必须仔细评估,因为荧光团显示出一定的自缔合倾向,这可能导致FRET的人为增加。
  FACS-FRET的另一个缺点是它只允许逐个细胞进行荧光测量。当然,这是由于流式细胞仪的功能,只允许单细胞测量。随之而来的是,尽管可以测量活细胞,但贴壁细胞与其底物的分离是测量的先决条件,因此排除了固体组织的测量。此外,细胞的必要胰蛋白酶消化也可能损害FRET。
  FACS-FRET不能检测细胞内的异质性,因为整个空间信息都会丢失。因此,为了检测荧光基团的亚细胞分布,荧光显微镜仍然是当今的金标准,甚至用于FACS-FRET实验中。然而,如前所述,成像流式细胞术可以在这里设定新的标准。
  长期以来,基于流式细胞术的FRAT的一个主要制约因素是其复杂性和缺乏标准化的方法。然而,近年来有了重大的进展和发展,从而越来越普及FACS-FRET。在这里,一个重要的里程碑是Banning等人设计了一种易于适应的FACS-FRET测定方法,允许在不同的实验环境中进行简单的再现。此外,它还促进了FACS-FRET的量化和统计分析。


其他文献中的一些FACS-FRET应用举例:

应用一:PPARγ分析
  PPARγ(过氧化物酶体增殖激活受体γ)是一种核激素受体,广泛参与调节细胞的脂质代谢、炎症反应和免疫过程。PPARγ的功能受其与多种共激活因子和共抑制因子的相互作用调控。因此,研究PPARγ的蛋白相互作用对于理解其在疾病中的作用至关重要。
Trümper等人(2019)开发了一种基于流式细胞术的FRET方法,用于分析活细胞中PPARγ1与其异二聚化伙伴RXRα的结合强度。该研究使用了Clover/mRuby2作为FRET反应对,通过流式细胞术检测了PPARγ1与RXRα之间的相互作用,并验证了该系统的特异性和灵敏度。此外,研究还探讨了PPARγ1与共抑制因子N-CoR2的相互作用,发现特定N-CoR2结构域的缺失显著降低了与PPARγ1的结合强度。Trümper等人(2020)的研究揭示了在LPS/IFNγ(经典激活)和IL4(替代激活)条件下,巨噬细胞内PPARγ的氧化还原状态发生显著变化。
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应用二:Tau的聚集分析以及细胞筛选
  Tau蛋白在阿尔茨海默病和其他神经退行性Tau病变中异常磷酸化和聚集。Prissette等人的研究使用了CRISPR-Cas9筛选技术在人类胚胎肾细胞(HEK293T)生物传感器细胞系中进行了筛选并利用Tau蛋白片段的FRET来定量分析细胞中的Tau聚集,研究发现了核膜完整性的破坏可能是Tau病变的启动事件,并揭示了治疗干预的潜在靶点。
  该研究使用Clover/mRuby2作为FRET反应对,先转染表达tau蛋白片段与荧光蛋白融合的质粒,建立稳定表达的细胞系,再通过添加Tau蛋白片段的聚集体或条件培养基,诱导细胞内tau蛋白的聚集,进而触发FRET信号。当两个 tau 融合蛋白进入紧密且有利的方向以诱导 CFP和 YFP之间的荧光共振能量转移(FRET)时,可检测到Tau片段的聚集。最后使用流式细胞术测量供体和受体的荧光强度,计算FRET效率,从而评估蛋白质间的相互作用强度。
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个人观点
  基于流式细胞术的FRET(FACS-FRET)相较于传统的共聚焦显微镜FRET技术,具有高通量、操作简便和易于数据标准化等优势。也面临一些问题,包括对细胞转染效率的依赖、可能的非特异性结合以及对细胞微环境变化的敏感性等。
但随着FRET与其他新兴生物技术的融合、FRET计算的算法迭代和近些年来流式的不断迭代和发展,例如全光谱流式、成像流式,FACS-FRET技术将更好地在相互作用、结合率的测定分析领域获得更广的应用前景,并且会在流式细胞分析、分选应用中占据重要位置。
  以上纯属个人兴趣和观点,欢迎讨论。


参考文献:
1.     Lim J et al. Flowcytometry based-FRET: basics, novel developments and future perspectives. CellMol Life Sci. 2022 Mar 30;79(4):217. doi: 10.1007/s00018-022-04232-2.
2.     Banning C et al. A flow cytometry-based FRET assay to identify andanalyse protein-protein interactions in living cells. PLoS One. 2010 Feb22;5(2):e9344. doi: 10.1371/journal.pone.0009344.
3.     Trümper V, et al. Flow cytometry-based FRET identifies bindingintensities in PPARγ1 protein-protein interactions in living cells.Theranostics. 2019 Jul 28;9(19):5444-5463. doi: 10.7150/thno.29367.
4.     Trümper V, et al. Redox Regulation of PPARγ in PolarizedMacrophages. PPAR Res. 2020 Jul 1;2020:8253831. doi: 10.1155/2020/8253831.
5.     Prissette M, et al. Disruption of nuclear envelope integrity as apossible initiating event in tauopathies. Cell Rep. 2022 Aug 23;40(8):111249.doi: 10.1016/j.celrep.2022.111249.




Flow cytometry-based FRET identifies binding intensities in PPARγ1 protein-prot.pdf

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