在自然环境中，微生物经常面临营养条件的波动，这要求它们在生长和生存之间取得平衡。Shabestary 等人最近发表在《Nature Communication》上的一项研究探索了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）如何在单细胞水平上适应氮限制。研究人员调查了将酵母细胞从富集培养基转移到 24 种不同氮源的影响，揭示了一个引人入胜的细胞分化过程。

先前的研究表明，微生物可以表现出表型异质性，即基因相同的细胞表现出不同的特征。这种异质性可以提供适应性优势，例如风险规避策略或更有效的资源分配。然而，这种分化的潜在机制和环境触发因素仍然知之甚少。

本研究的作者着手使用多组学方法（包括 RNA 测序、代谢生物传感器和高通量显微镜）来表征酵母亚群的代谢反应。通过检查超过80万个细胞，揭示了不同的氮源如何影响具有不同生长速率和生存能力的不同亚群的形成。

流式相关的方法
1、菌株和培养条件:
- 研究人员使用在RPL28启动子控制下表达超级折叠GFP (sfGFP)的酿酒酵母BY4741菌株。细胞最初在富含YPD(酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖)培养基中生长，直至达到指数生长期。

2、氮源下调:
- 细胞用PBS洗涤两次，并重悬于以下三种培养基条件之一:

a) YPD(富含培养基对照)

b) NLIM-GLN(谷氨酰胺作为氮源的氮限制培养基)

c) NLIM-PRO(脯氨酸作为氮源的氮限制培养基)


3、流式细胞术样品制备:
- 在转移后的各个时间点(0、2、4、6和8小时)，收集样品进行流式细胞术分析。将细胞用PBS稀释至适合分析的浓度。

4、归一化:
- 考虑到细胞大小对荧光强度的潜在混杂效应，研究人员将pRPL28-sfGFP荧光强度按细胞大小进行归一化处理。

5、亚群分选:
- 根据前向散射(细胞大小)和GFP荧光强度,将细胞分为"高"和"低"两部分。这一分选步骤对下游分析至关重要，包括对特定亚群进行RNA测序。

6、时间序列分析:
- 在多个时间点(每2小时测量一次，持续8小时)进行流式细胞术分析，以跟踪亚群出现的动态以及细胞大小和pRPL28-sfGFP强度随时间的变化。

7、补充技术:
虽然流式细胞术是分析单细胞表型的主要方法,但研究人员还采用其他技术来验证和扩展他们的发现:

a) 显微镜:使用延时成像来观察单细胞行为并确认流式细胞术结果。

b) 钙黄白素染色:这种技术用于可视化和计数出芽疤痕,提供有关分选亚群中细胞年龄和分裂历史的信息。

通过将这些流式细胞术方法与其他单细胞分析技术相结合,研究人员能够全面表征酵母群体对不同氮源产生的表型异质性。


结果
1、不同亚群的出现：

流式细胞术分析表明，在转移到氮限制条件（NLIM-PRO和NLIM-GLN）后的4小时内，酵母细胞形成了两个截然不同的亚群。这些亚群的区别在于细胞大小（通过前向散射测量）和pRPL28-sfGFP荧光强度的不同。
- "低"亚群：细胞体积较小，pRPL28-sfGFP荧光较低
- "高"亚群：细胞体积较大，pRPL28-sfGFP荧光较高，与转移前在富培养基（YPD）中的水平相似

2、依赖氮源的动态变化：

研究人员观察到，不同氮源条件下亚群维持的模式存在差异：
- NLIM-PRO（脯氨酸）：随时间推移，始终保持明显的双峰分布
- NLIM-GLN（谷氨酰胺）：最初呈双峰分布，但随时间推移逐渐变为单峰分布（仍然存在异质性）

3、亚群的定量分析：

通过根据细胞大小和荧光对细胞进行聚类，研究人员发现，从转移后4小时开始，与NLIM-GLN相比，NLIM-PRO中显著更多的细胞被归类为"低"亚群。

4、转录组分析：

转移后1小时对分选的亚群进行RNA测序（subpopRNAseq）揭示：
- 与先前发表的单细胞RNA测序数据具有良好的相关性
- "低"亚群中G1期特异性的子代标记物（DSE1和DSE2）表达上调
- 亚群之间细胞周期进程、减数分裂、MAPK信号通路和DNA修复相关基因的差异表达

5、静止特征：

"低"亚群展现出静止状态的特征，包括：
- 可逆的生长阻滞
- 静止标记物的表达上调
- 自噬相关基因的表达增加

6、子代细胞富集：

流式细胞术分选和显微镜分析显示，“低”亚群中富集了子代细胞：
- 在NLIM-PRO条件下，“低”亚群中约80%的细胞在再生长2小时后为子代细胞。
- 在NLIM-GLN条件下，“低”亚群中只有约30%的细胞在再生长2小时后为子代细胞。

7、亚群动态：

时间序列分析和细胞追踪实验显示：
- “高”亚群的细胞可以随时间重新生成“低”亚群。
- 在NLIM-PRO条件下，“低”亚群中的大多数细胞保持在该状态，细胞大小和pRPL28-sfGFP强度缓慢增加。
- 在NLIM-GLN条件下，“低”亚群的细胞表现出更明显的细胞大小和pRPL28-sfGFP强度增加，最终达到与“高”亚群相似的水平。

8、氮浓度的独立性：

在不同氮浓度下，细胞大小和pRPL28-sfGFP荧光的单峰或双峰模式均保持不变，表明这种表型主要由氮源的特性而不是浓度决定。

9、单细胞表型：

延时显微镜显示在NLIM-PRO条件下存在三种不同的表型：
- 完全失去荧光且细胞萎缩（<2%的细胞，可能为细胞死亡）
- 保持荧光并继续细胞分裂
- 荧光减少且生长减缓（类似静止状态）

综上所述，本研究表明酵母细胞在氮源减少时通过形成不同的亚群来表现出不同的生长和生存特性。氮源的种类对于这些亚群的稳定性和动态变化起着关键作用，其中脯氨酸相比谷氨酰胺更能促进一种更为稳定的类似静止状态。这些发现为单细胞生物如何适应营养压力并在群体水平上调节其代谢提供了重要的证据。

参考文献：Shabestary, K., Klemm, C., Carling, B. et al. Phenotypic heterogeneity follows a growth-viability tradeoff in response to amino acid identity. Nat Commun 15, 6515 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-50602-8