2010年8月1日前归档

1.13 W niwanmao 管理组

标题:调节性T细胞(Treg)系列6-FOXP3的胞内染色步骤

  1. Perform cell surface staining as described in BioLegend’s Cell Surface Immunofuorescence Staining Protocol.
  2. Add 1 ml of 1X BioLegend’s FOXP3 Fix/Perm solution to each tube, vortex and incubate at room temperature in the dark for 20 minutes, then spin down the cells and remove the supernatant.
  3. Wash once with cell staining bufer (Cat. No. 420201) by spinning at 250 X g for 5 minutes and remove the supernatant.
  4. Wash once with 1ml 1X BioLegend’s FOXP3 Perm bufer.
  5. Re-suspend cells in 1ml 1X BioLegend’s FOXP3 Perm bufer, incubate at room temperature in the dark for 15 minutes, spin down cells and discard the supernatant, then resuspend the pellet in 100 µl of 1X BioLegend’s FOXP3 Perm bufer.
  6. Add appropriate amount of fuorochrome conjugated anti-FOXP3 antibody and incubate at room temperature in the dark for 30 minutes.
  7. Wash twice with cell staining bufer, and resuspend in 0.5ml cell staining bufer then analyze with fow cytometer with appropriate instrument setting.

NOTE: BioLegend’s FOXP3 Fix/Perm Bufer Set (Cat. No. 421403) is specially developed and formulated for intracellular staining FOXP3 with minimum efect on surface fuorochrome staining and is highly recommended for optimal FOXP3 intracellular immunofuorescent staining results.

Related Information:
1. Roncador, G., et al., 2005 Eur. J. Immunol. 35:1681.

Reagent List:
1. Cell Staining Bufer (Cat. No. 420201)
2. FOXP3 Fix/Perm Bufer Set (Cat. No. 421403)

回答者:tianwm121

为什么网页无法保存?如何才能将好的内容保存下来。急盼!多谢

 

2009年8月12日 0:54

回答者:niwanmao

tianwm121,出于某些原因,网页是无法直接保存的。请通过复制粘贴的方式将你喜欢的内容粘贴至记事本或Word中保存。

2009年8月12日 0:54

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有 17 条回复

推荐 niwanmao 楼主


这类含量少的细胞,我个人更倾向于用全血做。如果提取可能会容易丢失。

2楼 浮生 LV2

请问这个试剂盒,划门该怎么办?

3楼 niwanmao 楼主

引用: 浮生 发表于 2012-1-4 17:26
请问这个试剂盒,划门该怎么办?

圈CD4+CD25+的细胞,分析FOXP3阳性的比例。

4楼 浮生 LV2

引用: niwanmao 发表于 2012-1-4 20:19
圈CD4+CD25+的细胞,分析FOXP3阳性的比例。

不是说是CD25high的细胞群么 能直接把CD25+的圈出来么

5楼 niwanmao 楼主

引用: 浮生 发表于 2012-1-4 21:26
不是说是CD25high的细胞群么 能直接把CD25+的圈出来么

CD25high是表达强度的一种表述方式,你可以在圈的时候就圈表达强度高一点的,这样FOXP3+的细胞纯一些,可以保证结果,参见http://jem.highwire.org/content/203/7/1701.full的FIGURE1。
是我之前表述上有点问题,抱歉。

6楼 浮生 LV2

引用: niwanmao 发表于 2012-1-5 08:13
CD25high是表达强度的一种表述方式,你可以在圈的时候就圈表达强度高一点的,这样FOXP3+的细胞纯一些, ...

学了很多,谢谢老师!

7楼 alina1123 LV2

请问老师,测Treg必须提单个核细胞来做吗?溶全血来标,可否?
我看抗体说明说上不推荐溶全血来做。

9楼 mimikiity LV2

perm buffer 需要室温15min是什么意思,后面在加抗体前还加了100μl的perm buffer ,这样抗体浓度不就稀释了吗?我记得以前看过老师建议抗体最好不要稀释了用。

10楼 niwanmao 楼主

引用: mimikiity 发表于 2013-10-29 09:59
perm buffer 需要室温15min是什么意思,后面在加抗体前还加了100μl的perm buffer ,这样抗体浓度不就稀释了 ...

你可能没仔细看上面的步骤,上面加入1ml perm buffer作用15分钟后,接下来是需要离心去上清,剩下的团块,加入100ul perm buffer和核内抗体,所以对抗体孵育体积没有影响。
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