2010年8月1日前归档

1.34 W niwanmao 管理组

标题:流式细胞仪检测细胞内ROS表达水平

1、取对数生长期的细胞,均以4×10E5/ml的密度接种于6孔培养板上;
2、培养过夜后,用相应药物处理细胞;
3、消化收集细胞(悬浮细胞不需要消化),要注意掌握消化时间,避免细胞碎片产生过多;
4、PBS缓冲液清洗一次,随后重悬细胞于1ml的PBS缓冲液中;
5、加荧光探针CM-H2DCFDA至终浓度10 uM ,37℃孵育30分钟,上流式细胞仪分析活细胞内ROS的积聚情况。

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有 12 条回复

2楼 矿泉水7 LV3

正好要做ROS检测,好好学习下!谢谢倪老师的分享!

3楼 苏格兰白草莓 LV2

请问ROS检测后如何分析 数据是使用荧光强度的平均值 还是峰的中值 还是峰面积下的几何均值?除此之外 是否还要除以该峰的细胞量 以使数据均一化呢?

4楼 苏格兰白草莓 LV2

做ROS时请注意酚红要去除 有些培养基里面含有酚红 在配液 或用无血清培养基洗涤的时候 注意应不含酚红 否则会影响检测

5楼 niwanmao 楼主

引用: 苏格兰白草莓 发表于 2014-10-20 14:04
做ROS时请注意酚红要去除 有些培养基里面含有酚红 在配液 或用无血清培养基洗涤的时候 注意应不含酚红 否则 ...

培养基要洗涤干净的吧。分析可以使用median,也可以用百分比。

6楼 苏格兰白草莓 LV2

引用: niwanmao 发表于 2014-10-20 19:45
培养基要洗涤干净的吧。分析可以使用median,也可以用百分比。

我看到有些ROS说明书上面写的是染色前用培养基来稀释到工作浓度  实验中也发现酚红对ROS探针有抑制作用
当我们的峰是偏态分布的时候 那个中值和几何均值差别还是有点大 我感觉几何均值更能反应ROS的真实情况些呢 还有个就是有时候峰比较宽 用百分比感觉不是很适合 检测ROS的时候是否有要求关于峰的CV值呢?没有必要除以细胞量来进行均一化了是不是啊?

7楼 niwanmao 楼主

引用: 苏格兰白草莓 发表于 2014-10-21 10:38
我看到有些ROS说明书上面写的是染色前用培养基来稀释到工作浓度  实验中也发现酚红对ROS探针有抑制作用
...

最好先洗涤吧。
至于结果的表示,我建议首选还是百分比。MFI是实在迫不得已才用的,关于MFI的使用,参考:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3848-1-1.html,并且需注意:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2427-1-1.html

8楼 lantianbaiyun LV2

倪老师,我最近在用流式测ROS,我遇到了很多问题,请倪老师帮我解答,我的实验组要用PTX处理4、6、8小时,这种情况也是先加药处理用PBS洗涤后,重悬后再加DCFH-DA?还是在时间点到之前前半个小时加DCFH-DA?谢谢倪老师了

9楼 niwanmao 楼主

引用: lantianbaiyun 发表于 2016-1-13 23:16
倪老师,我最近在用流式测ROS,我遇到了很多问题,请倪老师帮我解答,我的实验组要用PTX处理4、6、8小时, ...

到时间点后,把药物洗涤2-3次去干净,再用DCFH-DA孵育。

10楼 lantianbaiyun LV2

引用: lantianbaiyun 发表于 2016-1-13 23:16
倪老师,我最近在用流式测ROS,我遇到了很多问题,请倪老师帮我解答,我的实验组要用PTX处理4、6、8小时, ...

到时间点后,把药物洗涤2-3次去干净,再用DCFH-DA孵育。
谢谢倪老师,我之前做过一次,在散点图中调电压找主群的时候,每次都是100%,这个结果正常吗?或者是电压调的太大了?谢谢倪老师
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