流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力

niwanmao

巨噬细胞是固有免疫系统的重要成员， 具有吞噬、 清除及呈递抗原异物的生物学功能， 是维持机体的正常生理状态所必需的 。


传统的显微镜镜检记数法检测巨噬细胞吞噬能力存在主观性强、 重复性差及耗时长等缺点， 影响实验结果的客观性与准确性。流式细胞仪技术用于巨噬细胞的吞噬率检测可以轻易地将观察细胞数从几百上升至几千， 而且具有分析速度快、 重复性好和特异性强等优点。荧光微球被细胞吞噬后， 其荧光信号可迅速被流式细胞仪检测， 具有荧光信号的巨噬细胞即视为出现吞噬现象， 可 快速、 准 确地测 定 巨噬细胞 的吞 噬率  。


《 保健食品检验与评价技术规范增强免疫力功能评价方法( 征求意见稿) 》 中要求用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球试验替代巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验》， 本研究的主要 目的是在征求意见稿的基础上， 摸索最佳实验条件， 从而使该方法能灵敏稳定的反映小鼠腹腔单核一 巨噬细胞吞噬能力。

本文利用流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球能力试验方法的灵敏性、 稳定性以及易操作性，结果发现：小鼠腹腔巨噬细胞浓度调整为1*10E5~2*10E5/ml，孵育1h，1 × 10E7／孔微球浓度可使实验快速而又精确地反映巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数。

巨噬细胞吞噬能力分析

【流式中文网注】该文的研究方法和计算公式值得学习，但分析图仅供大家参考，因为其中流式细胞仪为C6，但实验结果中用FL2分析FITC荧光，似乎不太对劲。


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winnebenben

同问，最近准备帮别人做“小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球试验”中的流式检测这一块，这是他发给我的试验方法中流式细胞仪检测分析的步骤： 流式细胞仪检测分析
1、 设门：首先设立FSC-SSC二维散点图，通过调节FSC和SSC电压值，以巨噬细胞设门界定分析的巨噬细胞群，最大限度地排除其它有核细胞、细胞碎片等的干扰；
2、 获取：在荧光微球发射光的荧光通路检测巨噬细胞的荧光强度，每份样本获取5000个巨噬细胞，数据可显示于二维散点图和直方图中。在二维散点图中可通过设门圈定未吞噬荧光微球的巨噬细胞群和吞噬荧光微球的巨噬细胞群；在直方图中可通过标尺标定未吞噬荧光微球的巨噬细胞群和吞噬荧光微球的巨噬细胞群，全部数据经相关软件分析未吞噬荧光微球的巨噬细胞和吞噬不同数量荧光微球的巨噬细胞的比例。

想问：1、FSC-SSC散点图中并不只有一群细胞，如何界定哪一群为巨噬细胞？
          2、图中用FL2-H来检测荧光，但是并没有标明是FITC，我们这的流式细胞仪是BD的FACS Calibur，FL2通道是PE通道，想知道该用哪个荧光通道来检测荧光微球？

          3、这个实验是取小鼠腹腔的巨噬细胞置于6孔培养板内，加入预调的荧光微球，37℃避光孵育后PBS洗涤两次，用细胞刮刮下贴壁细胞PBS重悬后75um过滤器过滤上机，如果从实验室取材到流式检测前这段时间超过1h，细胞需要加固定液吗？不加固定液细胞坚持得了吗？

niwanmao

winnebenben 发表于 2015-3-20 14:45
同问，最近准备帮别人做“小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球试验”中的流式检测这一块，这是他发给我的试验方法 ...

1、是一群细胞，只是FSC大小略有不同，你可以理解为高矮胖瘦不同的一群人。
2、一般这类微球是515nm发射波长，按道理应该在FL1通道检测，但很奇怪，在那些文章中都是放在FL2分析，我因为没做过这类实验，只能说理论上应该FL1。
3、一般来说，如果你时间点到了，处理好最好尽快上机，时间过长容易导致细胞死亡或活力变差，或功能改变，结果不准确。加固定液没有用，因为这是由于巨噬细胞吞噬，而不是表面的荧光标记。

winnebenben

好~谢谢倪老师的解答{:soso_e113:}

半年y

相应Beads的货号可以分享一下吗？
还有就是想问一下老师们，二楼是采用形态学画门的巨噬细胞，可不可以进行biomarker的染色去确定巨噬细胞？当然，是选用和beads不同的荧光。