2010年8月1日前归档

8930 niwanmao 管理组

标题:流式检测细胞自噬?
可否用流式检测药物作用后细胞自噬的情况?
比如用吖啶橙染色。。。
问题补充: 为什么需要破膜呢?
我们这教的是直接拿配好的吖啶橙染贴壁细胞,然后消化,用含10%FBS的PBS终止消化后直接上流式检查。。因为是单染,所以不是很清楚怎么区分阳性细胞群。
要是能有几张标准的流式图看看就好了、、、
谢谢高手了。。。


回答者:niwanmao
当然可以用吖啶橙来检测细胞中的酸性囊泡,来反应细胞自噬程度。
大概在2008年我帮别人测过,具体方法我当时从Current protocol in cytometry中翻译过,请参见如下:

材料:
  • 细胞密度≤106/ml,悬浮在包含10%血清的培养基中
  • 吖啶橙染液,冰冷(详细配制见文末 。AO-DNA或AO-RNA的激发波长为488nm,发射波长分别为530±15nm[FL1]、640nm[FL3])
  • 细胞破膜剂,冰冷(详细配制见文末)

具体步骤:
  • 转移0.2ml细胞悬液到流式管中,置于冰上。(0.2ml应该有≤2×105的细胞,培养基中的10%血清或1%的BSA可以保护细胞以免被去污剂裂解)
  • 轻轻加入0.4ml冰冷的细胞破膜剂,置于冰上等待15秒钟。
  • 轻轻加入1.2ml冰冷的吖啶橙染液,置于冰上,避光。
  • 在加入吖啶橙染液后的2~10分钟内检测和记录细胞的荧光。(注意:检测前和检测中标本都应该置于冰上。如果以涡旋振荡或注射方式把细胞加入破膜剂中,尤其是在没有血清或其它蛋白保护时,可能会导致胞膜破裂或胞核分离出来。)

需自配的部分试剂:
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2009年8月12日 0:54

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有 10 条回复

推荐 小小研究生 LV2

本帖最后由 小小研究生 于 2015-7-7 22:10 编辑
引用: 小小研究生 发表于 2015-7-7 19:58
我这次用AO染色,荧光显微镜下成像。可以清楚的看到红色或黄色荧光没有使用破膜剂,浓度是自己摸索的,接下 ...

这是一篇关于AO染色,流式的文献
有一个小问题,流式图形看那一部分?是右上角的百分比,还是全部上面部分的百分比?

    JMC.pdf  (2015-7-7 22:08 上传)

    1.34 MB, 下载次数: 50

2楼 marshlin LV2

Protective Effect of Autophagy in Laser-Induced Glioma Cell Death In Vitro 2010 这篇文献中并没提到用细胞破膜剂进行操作。
而且我们做过只用荧光显微镜拍照的AO自噬染色,是终浓度1μM,也不用破膜剂。
接着我们也准备用流式去做,做好后结果再跟大家讨论。

3楼 niwanmao 楼主


吖啶橙本身就具备直接渗透,应该是可行的,但染色的强度就不清楚了。期待你的分享

4楼 simon911 LV2

学习下咯

5楼 小小研究生 LV2

我这次用AO染色,荧光显微镜下成像。可以清楚的看到红色或黄色荧光没有使用破膜剂,浓度是自己摸索的,接下来准备做流式了。有结果再分享。。。

7楼 小小研究生 LV2

老师,做流式AO检测自噬,我应该怎么样画门?使用FL3-FL1log 形式?请老师解答

8楼 niwanmao 楼主

引用: 小小研究生 发表于 2015-7-8 17:54
老师,做流式AO检测自噬,我应该怎么样画门?使用FL3-FL1log 形式?请老师解答 ...

是的。

9楼 风过即逝 LV2

老师,您好,我一直不太清楚AO染色是红色标出的到底是酸性囊泡还是RNA,两者相互矛盾吗,期待您的解答!

10楼 niwanmao 楼主

引用: 风过即逝 发表于 2018-1-2 21:37
老师,您好,我一直不太清楚AO染色是红色标出的到底是酸性囊泡还是RNA,两者相互矛盾吗,期待您的解答! ...

这确实是个问题,RNA应该还是无法排除干扰的,我也找了好多测自噬的文章,似乎也都没有提及对RNA的处理。
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