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2926 maxue LV2

B20-1B.jpg  (2018-4-8 14:20 上传)

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请问倪老师,Q1代表Treg细胞所占比例,0.8是不是意味着Treg细胞几乎没有?
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有 7 条回复

2楼 liuruiluna LV4

FSC/SSC看起来细胞就不太清楚,细胞处理好像不太好,最好加个死活染料,另外应该加上CD25标志,这样分群能更清楚准确。而且配色比较怪,应该给FoxP3用PE啊,给CD4 CD8都用了那么亮的颜色,表达很弱的FOXP3 却用了FITC的不太亮的颜色

3楼 liuruiluna LV4

还有黏连体也应该去一下

4楼 maxue 楼主

引用: liuruiluna 发表于 2018-4-8 09:40
还有黏连体也应该去一下

谢谢您的解答,刚开始做流式,基础知识了解的不够,可是现在抗体都已经买了。这个是脑组织的流式,脑细胞容易死亡,可能细胞碎片以及一些脂质碎屑比较多。用同样的流程(除了获得单个细胞悬液细胞的过程不同)染的脾脏的Treg看起来还挺正常的(如下图)。应该用CD4、FoxP3来标记Treg也是可以的吧?一些文献里面就只染了这两个。那这个结果中0.8%的Treg细胞是不是相当于没有呢?因为现在急着想确定Treg细胞在造模后数目是不是有上升,之前做免疫组化没有结果。

B20-1S.jpg  (2018-4-8 12:32 上传)

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5楼 liuruiluna LV4

本帖最后由 liuruiluna 于 2018-4-8 14:23 编辑

做这一次应该不好确定是实验方法问题还是本来就是这样的结果。

CD25最好是加的。原因不赘述,主要就是可靠性,精确度。你现在这个图的分群也分的不开,特异性不好说。尤其是您用的样本还不是典型的脾细胞,用更多的marker标记,特异性才更符合普遍认知,所以建议CD25最好加上,特别是小鼠的,经典的表面marker就CD4CD25,还不给加全了怕编委会有challenge,用一些文献不太有说服力,毕竟大家普遍都要有CD25,到时候补实验就更糟心了

如果样本有很多死亡、碎片的情况,更要加去黏连体和死活染料。加了之后分群也会更好,非特异性也会降低。现在的这个比例不一定准的。因为可能有很多其他的非特异性结合在其中。

再就是破膜剂效果怎样,破膜剂效果不好,FoxP3染不上 比例也会很低。


另外你看0.8%的比例不能说是几乎没有,毕竟有那么一个阳性群在那,0.8%是占所有events的比例,不是占免疫细胞的比例,里面有大量的碎片被计算进去。你现在的图Q1门的比例占parent的比例有14%   占所有events 比例是 50%x10.9%x14%_(但如果不排除碎片,这个数值没有意义),

整体上从标记、到设门和统计分析都需要优化一下

6楼 niwanmao 管理组

1、建议Treg方案用CD3、CD4、CD25、foxP3。
2、图中0.8%是占Total的比例,一般Treg都是计算其占CD4+细胞的比例或占CD3+T细胞的比例。

7楼 maxue 楼主

引用: liuruiluna 发表于 2018-4-8 13:54
做这一次应该不好确定是实验方法问题还是本来就是这样的结果。

CD25最好是加的。原因不赘述,主要就是可 ...

万分感谢您的耐心解答,那PE标记的CD25抗小鼠的流式抗体有没有推荐的克隆号呢?

8楼 maxue 楼主

引用: niwanmao 发表于 2018-4-8 14:22
1、建议Treg方案用CD3、CD4、CD25、foxP3。
2、图中0.8%是占Total的比例,一般Treg都是计算其占CD4+细胞的 ...

好的,谢谢您!